韓宗元 江連洲 李 楊 齊寶坤 王勝男 王 曉 陳 勇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）

（沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院2，撫順 113122）

水酶法提取大豆油的擴(kuò)大試驗(yàn)研究

韓宗元1，2江連洲1李 楊1齊寶坤1王勝男1王 曉1陳 勇1

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）

（沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院2，撫順 113122）

水酶法提取大豆油的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，因此在實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；A(chǔ)上，進(jìn)行了水酶法提取大豆油的擴(kuò)大試驗(yàn)。在10 L反應(yīng)釜中，每次試驗(yàn)需要1.2 kg的擠壓膨化大豆片。通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)加酶量、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得出最優(yōu)結(jié)果：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時(shí)間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率（69.02±0.55）%。并且，通過(guò)透射電鏡和光學(xué)顯微鏡觀(guān)察、研究，揭示出水酶法提取大豆油的釋放機(jī)理，以便于提高水酶法的油脂提取率和油的品質(zhì)。最后，通過(guò)比較水酶法和溶劑浸提法，結(jié)果表明：水酶法提出的大豆油品質(zhì)更好，過(guò)氧化值更低。

大豆油 水酶法 擴(kuò)大試驗(yàn) 油脂提取率

有機(jī)溶劑浸提中使用的正己烷是由多種同分異構(gòu)體組成，易燃易爆，且利用不可再生資源生產(chǎn)的有機(jī)溶劑。由于正己烷能夠破壞環(huán)境，因此人們渴望找到可以替代有機(jī)溶劑提取的方法，逐漸對(duì)水代法產(chǎn)生了濃厚的興趣，因?yàn)樗ú粌H沒(méi)有有機(jī)溶劑，還能同時(shí)獲得油脂和蛋白［1-3］。

雖然水代法可以替代溶劑萃取法，但是水代法有許多難題要解決，包括提取率低和產(chǎn)生大量乳狀液等。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模試驗(yàn)中，水代法提取率低，所以酶［5-6］和機(jī)械處理可以應(yīng)用到水代法中提高提取率。機(jī)械處理包括壓片和擠壓膨化［4，7］。酶能夠起到破壞細(xì)胞壁和磷脂膜結(jié)構(gòu)的作用，因此加入各種酶的水代法應(yīng)用于大豆［8］，油菜籽［10］，椰子［11］，葵花籽［12］等油的浸提中。所以，水酶法可以很好地解決水代法的困難，而且達(dá)到較高地提取率和破乳率。水酶法提取大豆油可以通過(guò)破乳來(lái)提高油脂的提取率，破乳方法包括酶法破乳和化學(xué)法破乳等［4］。

在實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；A(chǔ)上，通過(guò)水酶法提取大豆油的擴(kuò)大試驗(yàn)，盡可能提高油脂提取率并且簡(jiǎn)單易行、以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全脂大豆壓片：吉林豐正大豆食品有限公司；Protex6L堿性蛋白酶：諾維信公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、石油醚、氫氧化銨、95%乙醇、酚酞 分析純：天津迪博化工股份有限公司。

10 L真空反應(yīng)釜、低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；pHS-3C型酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠(chǎng)；大功率粉碎機(jī)：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；振蕩過(guò)篩機(jī)：新鄉(xiāng)市大漢振動(dòng)機(jī)械有限公司；擠壓膨化機(jī)：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水酶法擴(kuò)大試驗(yàn)提取大豆油方法

擠壓膨化機(jī)將全脂大豆片擠壓膨化，再經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩后，取1.2 kg物料加入到真空反應(yīng)釜中，加水調(diào)節(jié)使料液比達(dá)到1∶6。用2 mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液pH到9.5，然后加物料質(zhì)量2.5%的Protex 6L，使溫度保持在55℃，反應(yīng)進(jìn)行3 h［4，9］。酶解后，混合液在超高速低溫離心機(jī)離心 20 min，轉(zhuǎn)速14 400 r／min。離心后，將最上層的游離油萃取出來(lái)，再將乳狀液收集，放入4℃冰箱內(nèi)保存，然后再進(jìn)行破乳，將破乳油和游離油收集到一起。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

通過(guò)研究酶解參數(shù)，即酶解時(shí)間、酶解溫度、料水比、pH、加酶量，確定4個(gè)因素不變，只改變1個(gè)因素，來(lái)確定各因素對(duì)油脂提取率的影響。各因素的范圍如下：pH 8～10，加酶量0.5%～3.0%，酶解時(shí)間2～4 h，酶解溫度45～65℃，料液比3～7。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取pH、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液料比5個(gè)因素為自變量，以油脂提取率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表

1.2.4 油脂提取率測(cè)定

物料的含油率通過(guò)AOAC 922.06方法測(cè)定，乳狀液含油率也通過(guò)AOAC 995.19法測(cè)定［13］。

1.2.5 透射電鏡和光學(xué)顯微鏡測(cè)定

通過(guò)透射電鏡和光學(xué)顯微鏡可以觀(guān)察到細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)DX-201透射電鏡和Zeiss LSM710光學(xué)顯微鏡進(jìn)行試驗(yàn)，觀(guān)察乳狀液中蛋白和脂肪變化情況［14-15］。

透射電鏡：前固定→漂洗→后固定→漂洗→50%乙醇脫水→70%乙醇脫水→90%乙醇脫水→100%乙醇脫水→100%乙醇和100%丙酮（1∶1）脫水→100%丙酮脫水→純丙酮和包埋液浸透→包埋→聚合→修快→超薄切片機(jī)切片→染色→觀(guān)察、拍片。

光學(xué)顯微鏡：0.2%考馬斯亮藍(lán)（R250）和蘇丹III染液分別對(duì)蛋白和油脂切片進(jìn)行染色，染色后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察。

1.2.6 油脂的品質(zhì)分析

2 kg全脂大豆片用正己烷浸提8 h，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除正己烷，得到大豆油［18］。根據(jù)水分及揮發(fā)物、折光指數(shù)、色澤、酸值、游離脂肪酸含量、過(guò)氧化值、p-茴香值、不皂化物、磷含量等指標(biāo)比較正己烷浸提法和水酶法提取的大豆油的品質(zhì)［17-19］。

1.2.7 脂肪酸分布測(cè)定

通過(guò)哈爾濱工程大學(xué)的HITZB-638氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)［18］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，n＝3。采用SAS9.13統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；差異顯著性采用SPSS19 Duncan檢驗(yàn)法，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 擴(kuò)大試驗(yàn)的酶解條件對(duì)水酶法油脂提取率的影響

Rosenthal等［5］對(duì)酶解參數(shù)進(jìn)行了研究，它能對(duì)油脂提取率起到巨大的影響。因?yàn)樗麄兡苡绊懠?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，并使酶達(dá)到最大的活性。研究指出擠壓膨化大豆片通過(guò)水酶法提取大豆油，油脂提取率達(dá)到 50%～70%［8］。

圖1a表示不同pH對(duì)油脂提取率的影響。隨著pH值增大，提取率先增大再減小，當(dāng)pH達(dá)到9.5時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大。圖1b表明加酶量對(duì)提取率的變化趨勢(shì)和pH相同，在加酶量為2.5%時(shí)，提取率達(dá)到最大。圖1c表示酶解時(shí)間對(duì)提取率的變化趨勢(shì)是先快速增加，再緩慢降低，在3 h附近達(dá)到最大值。圖1d表明酶解溫度對(duì)提取率的趨勢(shì)變化極大，提取率從30%到65%，在55℃時(shí)達(dá)到最大。圖1e表明料液比的變化趨勢(shì)不同于其他因素，因?yàn)樗?∶3和1∶4時(shí)快速增加，然后從 1∶4到 1∶5，提取率幾乎不變，最終在1∶6達(dá)到最大值。

圖1 酶解條件對(duì)油脂提取率的影響

2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解參數(shù)。以加酶量 x1，pH x2，酶解時(shí)間 x3，酶解溫度 x4，液料比x5為自變量，油脂提取率y為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)號(hào)1～24為析因試驗(yàn)，25～36為中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果

表2 （續(xù)）

通過(guò)SAS9.13得到響應(yīng)面回歸方程式，如下：

Y＝-11．40+69．12x1+1．58x2+0．78x3+0．09x4+0．19x5-536．88x12-4．79x1x2+0．28x1x3+0．02x1x4-1．33x1x5-0．09x22-0．01x2x3+0．004x2x4-0．001x2x5-0．09x32-0．002x3x4+0．001x3x5-0．001x42+0．001-0．02

表3 回歸與方差分析結(jié)果

表3表明獨(dú)立和非獨(dú)立變量的線(xiàn)性關(guān)系是顯著的，此模型是顯著的（P＜0.000 1），失擬不顯著。而且，模型的決定系數(shù)（R2＝0.970 9＞0.800 0）說(shuō)明試驗(yàn)誤差低，模型正確。結(jié)果證明此模型能很好地匹配和分析數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

按照顯著性檢驗(yàn)，含有 x1，x2，x3，x4，x1x2，x2x4，的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)油脂提取率有顯著影響（P＜0.05），并且其他因素不顯著（P＞0.05），這說(shuō)明各因素的影響是復(fù)合的，因?yàn)榇嬖诮换ロ?xiàng)。圖2和圖3表示交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)。表3反應(yīng)通過(guò)F檢驗(yàn)得到因素貢獻(xiàn)率為：x1＞x2＞x4＞x3＞x5（加酶量＞pH＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞料液比）。

當(dāng)固定3個(gè)因素的零水平，圖2和圖3表示另外2個(gè)顯著交互項(xiàng)的響應(yīng)面和等高線(xiàn)。兩對(duì)顯著交互項(xiàng)可從表3獲得，分別為：加酶量和pH，pH和酶解溫度。圖2表明：當(dāng)把x3，x4和x5調(diào)節(jié)到零水平，在低水平pH下，加酶量對(duì)油脂提取率影響較小，在高水平pH下，加酶量對(duì)油脂提取率影響很大，隨著加酶量增大，油脂提取率先增大后平緩趨勢(shì)。pH對(duì)油脂提取率的趨勢(shì)和加酶量的相同。圖3表示當(dāng)把x1，x3和x5調(diào)節(jié)到零水平，pH和酶解溫度對(duì)油脂提取率的影響的變化趨勢(shì)都是先上升后下降。

圖2 顯著交互項(xiàng)加酶量和pH的響應(yīng)面分析

圖3 顯著交互項(xiàng)pH和酶解溫度的響應(yīng)面分析

2.3 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證

響應(yīng)面分析法得到的最佳條件如下：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時(shí)間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率預(yù)測(cè)值（69.02±0.55）%。

在最佳條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，酶解條件為：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時(shí)間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04。3次試驗(yàn)結(jié)果分別為：68.67%，68.79%，68.51%。3次平行試驗(yàn)的平均值為68.66%，這說(shuō)明響應(yīng)值符合回歸預(yù)測(cè)值，并且模型能預(yù)測(cè)產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際條件。

2.4 水酶法的油脂釋放機(jī)理的顯微鏡分析

在水酶法提取過(guò)程中，隨著酶解進(jìn)行，開(kāi)始形成水包油型乳狀液。雖然乳狀液中含有超過(guò)50%的油，但是許多蛋白質(zhì)包圍乳狀液中的油，阻止油脂釋放［16］。因此，使油脂釋放需要破壞蛋白質(zhì)。蛋白體的變化范圍為直徑10到50μm。一般來(lái)說(shuō)，直徑大的蛋白體比小的更容易破壞其結(jié)構(gòu)［16］。在圖4a中，當(dāng)酶解1 h，大量的蛋白體聚集在一起并且包圍著油體。少量油體從蛋白體中分離出來(lái)，但是大量的油體與蛋白體結(jié)合，被稱(chēng)作油質(zhì)體［16］。在圖4b和圖4c中，當(dāng)酶解分別進(jìn)行2 h和3 h，蛋白體的覆蓋逐漸變少，油體開(kāi)始聚集形成小油滴。最后，當(dāng)包圍油滴蛋白體完全被破壞，小油滴聚集形成大油滴。在pH 4.5條件下破乳后，蛋白體分離出來(lái)，然后變小分散如圖4d。最后，越來(lái)越多的油體聚集形成油滴。

圖4 乳狀液的透射圖像

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，可知在水酶法過(guò)程中油脂釋放情況，并了解其釋放機(jī)理。首先，在水溶液中，乳狀液開(kāi)始形成，大量蛋白體包圍油體并且油體非常小如圖5a。然后，油體開(kāi)始聚集結(jié)合形成小油滴如圖5b和5c。最后，破乳后，在圖5d中大量油滴聚集釋放。

圖5 乳狀液的光學(xué)顯微鏡圖片

2.5 水酶法和溶劑浸提法的大豆油品質(zhì)分析

在表4中，通過(guò)比較水酶法和溶劑浸提法的大豆油的品質(zhì)得到結(jié)果：水酶法提取的大豆油品質(zhì)更好，并且其水分及揮發(fā)物、過(guò)氧化值、p-茴香值和磷的含量與溶劑浸提法的值有顯著的不同（P＜0.01）和Jung等［17］研究的結(jié)果相近。過(guò)氧化值和p-茴香值分別是檢測(cè)初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物的指標(biāo)。很顯然，無(wú)論哪種提取方法，較低的過(guò)氧化值是令人期望的。表4表示2種提取方法的大豆油指標(biāo)和脂肪酸組成分布。

表4 正己烷提取法和水酶法提取大豆油的特征值

3 結(jié)論

在水酶法提取大豆油的擴(kuò)大試驗(yàn)中，以36組響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件將油脂提取率從30%增加到69%。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件為加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時(shí)間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率達(dá)到（69.02±0.55）%。通過(guò)透射電鏡和光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，得到水酶法的油脂釋放機(jī)理，并且進(jìn)一步提高提取工藝和油的品質(zhì)。

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Scale-Up of Soybean Oil from Enzyme-Assisted Aqueous Extraction Processing

Han Zongyuan1，2Jiang Lianzhou1Li Yang1Qi Baokun1Wang Shengnan1Wang Xiao1Chen Yong1
（College of Food Science and Engineering，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）
（College of Life Engineering，Shenyang Institute of Technology2，F(xiàn)ushun 113122）

Enzyme-assisted aqueous extraction processing（EAEP）has made great progress in extracting soy-

bean oil.On the basis of laboratory-scale，scale-up of the extraction of soybean oil has been carried out.There was a need of 1.2 kg extruded soybean flakes for every experiment in a 10 L jacketed reactor.The hydrolysis conditions which contains the amount of enzyme，pH，hydrolysis temperature，hydrolysis time and solids-to-liquid ratio were discussed to get the optimal parameters in single factor and response surface experiments.The results were as follows：the amount of enzyme 1.92%，pH 9.15，hydrolysis time 3.09 h，hydrolysis temperature 56.15℃，solids-to-liquid ratio 1∶5.04 and oil extraction efficiency（69.02±0.55）%.In conclusion，the mechanism of oil release from EAEP was revealed by transmission electron microscopy and light microscopy for further improvement of extraction efficiency and oil quality.Comparing with solvent extraction，oil quality from EAEPwas better and the peroxide value was lower.

soybean oil，enzyme-assisted aqueous extraction processing，scale-up，oil extraction efficiency

TS22

A

1003-0174（2015）02-0037-07

863計(jì)劃（2013AA102104）

2013-10-23

韓宗元，男，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程