趙靜靜,王偉靈,周麗霞,楊沁彤,張 瑩,趙延榮,邢嘉翌
(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院,安徽蚌埠233030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海200082;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科,上海200082)
糖尿病足(diabetic foot,DF)是由神經(jīng)病變、血管病變及感染三者相互作用的結(jié)果,而感染是病變加重的重要誘因,約15% ~25%的糖尿病患者會在其一生中發(fā)生足部潰瘍[1]。大量研究表明血管病變和炎癥反應(yīng)在DF發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[2]。張瑩等[3]研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原(fibrinogen,F(xiàn)IB)作為炎癥因子,隨著DF潰瘍嚴(yán)重程度的加重而逐漸升高,是DF發(fā)生的獨(dú)立危險因素。血漿FIB水平和分子功能的表達(dá)主要受遺傳和環(huán)境等因素的影響,其中遺傳是重要的決定因素。大量研究表明FIB β鏈的合成及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)在FIB合成過程中起主要調(diào)節(jié)作用。FIB基因啟動子區(qū)rs6056 SNP位于4q32 FGB編碼區(qū)內(nèi),與FIB水平的升高具有相關(guān)性[4]。目前尚未有該基因SNP與DF相關(guān)性的報道。我們探討了FIB水平及FIB基因rs6056 SNP與DF的關(guān)系,為預(yù)防DF的發(fā)生提供依據(jù)。
隨機(jī)選擇2013年1月至2014年3月在上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科住院的DF患者(DF組)123例,男72例,女51例,年齡(70±11)歲;同期內(nèi)分泌科住院的無足部潰瘍的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者(T2DM 組)97例,男55例,女42例,年齡(67±9)歲。篩選同期健康體檢者80名作為正常對照組,男46名,女34名,年齡(69±10)歲。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國糖尿病協(xié)會2012年發(fā)布的《糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)(2012版)》[5]。DF的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年國際DF工作組(International Working Group,IWGDF)發(fā)布的《糖尿病足國際臨床指南》[6]。DF的分級參照Wagner分級方法[7]。
1.納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)正常對照組選擇年齡和性別等與病例組相匹配的,排除高血脂、糖調(diào)節(jié)異常及臨床下肢血管病變者;(3)樣本采集過程符合倫理學(xué)要求,所有入選者均已簽署知情同意書。
2.排除標(biāo)準(zhǔn) (1)不符合以上納入標(biāo)準(zhǔn);(2)近半年內(nèi)有急性心肌梗死、腦梗死或出血者;(3)合并有嚴(yán)重肝、腎功能不全,心力衰竭,血液病,惡性腫瘤等疾病以及精神病患者;(4)存在其它感染性疾病者。
收集患者的一般臨床資料,包括年齡、性別、糖尿病病程及體重指數(shù)(body mass index,BMI)等。
抽取入選患者外周靜脈血2 mL,嚴(yán)格按照Axy Prep全血基因組DNA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行DNA提取。
應(yīng)用多重聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)法(polymerase chain reaction-ligation detection reaction,PCR-LDR)檢測 FIB基因 rs6056(ID:2244)位點(diǎn)的多態(tài)性。Taq酶體系購自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司,上、下游引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。上游引物:5'-ACGAAGCACACGAAGGTTAG-3',下游引物:5'-CTCAGAACTGGAAAAGCACC-3'。
1.PCR反應(yīng)體系 總體系為20μL。1×PCR緩沖液2μL,3 mmol/L Mg2+0.6μL,2 mmol/each dNTP 2μL,1 U Taq 酶 0.2μL,ddH2O 12.2μL,0.5 pmol上、下游引物模板各1μL。多重 PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性90 s,50 ℃退火90 s,65 ℃延伸30 s,循環(huán)40次;65℃再延伸10 min終止反應(yīng)。以上反應(yīng)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后,取2μL反應(yīng)產(chǎn)物在3%瓊脂糖膠、0.5×TBE中電泳,檢測反應(yīng)的特異性。剩余樣本保存于-20℃。
2.PCR產(chǎn)物的連接酶檢測反應(yīng)體系 總體系為10μL。1×PCR 緩沖液 1μL,probe mix(each)1μL,Taq DNA 連接酶0.05μL,ddH2O 4μL,PCR產(chǎn)物4μL。95 ℃變性2 min,94 ℃延伸15 s,50 ℃退火25 s,循環(huán)40次。以上反應(yīng)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
3.基因測序 取多重PCR-LDR產(chǎn)物1μL,加1μL ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1μL去離子甲酰胺上樣液混合,進(jìn)行電泳,在3730XL DNA Analyzer測序儀(Applied Biosystems/HITACHI,ABI)上進(jìn)行測序。應(yīng)用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。
FIB采用CAI500全自動血凝儀(日本Sysmex公司)及 Dade Behring公司試劑檢測;白細(xì)胞(white blood cell,WBC)計數(shù)采用 SYSMEX XE-2100全自動血液分析儀及配套試劑檢測(日本Sysmex公司);空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)PG)、餐后2 h血糖(2 hour postprandial blood glucose,2 hPG)使用Roche公司試劑(葡萄糖氧化酶比色法),在HITACHI 7600-020全自動生化分析儀(日本日立公司)上測定,糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C,HbA1C)采用D-10糖化血紅蛋白分析儀(Bio-Rad公司)檢測,所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析?;蛐?、等位基因頻率及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測采用 SHEsis(http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析。如符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,則表明研究對象是來自同一群體,具有較好的代表性。各組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn),以野生型純合子CC作為對照,采用非條件Logistic回歸計算比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI),用以說明不同基因型和等位基因與DF的發(fā)病風(fēng)險。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示,3組間比較采用單因素方差分析,方差齊性資料采用LSD檢驗(yàn),方差不齊資料采用Tamhane’s T2(M)檢驗(yàn)。計數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計推斷。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
DF組WBC和FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組(P<0.05),DF組病程較T2DM組長(P<0.05)。3組間年齡及性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)
表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)
注:與正常對照組比較,*P <0.05;與 T2DM 組比較,#P <0.05
組別 例數(shù) 年齡(歲) 病程(年) FPG(mmol/L) WBC(×109/L) FIB(g/L)DF 組 123 70 ±11 14.72 ±8.32# 8.06 ±3.82* 8.31 ±6.84*# 3.95 ±1.20*#T2DM 組 97 67 ±9 10.11 ±7.73 8.44 ±3.79* 6.38 ±1.65 2.81 ±0.75*正常對照組80 69 ±10 - 5.47 ±0.48 5.83 ±1.53 2.15 ±0.81
根據(jù)Wagner分級將DF組分為0~Ⅲ級(57例,男33例、女24例)、Ⅳ級(56例,男33例、女23例)、Ⅴ級(10例,男6例、女4例)。WagnerⅤ級患者WBC和FIB水平均明顯高于WagnerⅣ級和Wagner 0~Ⅲ級患者(P均<0.05);3組間年齡、病程及 BMI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均 >0.05)。見表2。
表2 DF組不同Wagner分級相關(guān)指標(biāo)的比較 (±s)
表2 DF組不同Wagner分級相關(guān)指標(biāo)的比較 (±s)
注:與0~Ⅲ級組比較,*P <0.05;與Ⅳ級組比較,#P <0.05
Wagner分級 例數(shù) 年齡(歲) 病程(年) BMI(kg/m2) WBC(109/L) FIB(g/L)8 ±0.95Ⅳ級組 56 70 ±12 14.50 ±8.26 23.54 ±4.64 8.88 ±9.43* 4.33 ±1.08*Ⅴ級組 10 66 ±12 16.30 ±7.86 21.18 ±3.55 13.56 ±3.90*# 5.63 ±0.36*#0 ~ Ⅲ級組 57 70 ±11 14.63 ±8.59 23.29 ±3.57 6.81 ±1.98 3.2
1.FIB基因rs6056位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測,各組樣本間rs6056位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=0.102、0.546、0.595,P >0.05),具有群體代表性。DF 組及T2DM組基因型及等位基因頻率分布與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。DF組Wagner不同分級間基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3、表4及圖1。
2.不同基因型間FIB水平比較 DF組TT基因型FIB水平明顯高于CC和CT基因型(P<0.05);T2DM組TT基因型 FIB水平高于CC和CT基因型(P<0.05),而CC和CT基因型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。DF患者中Wagner 0~Ⅲ級組TT和CT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P<0.05),WagnerⅣ級組TT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P<0.05)。正常對照組及 DF組 WagnerⅤ級3種基因型間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 見表6。
表3 DF組、T2DM組及正常對照組FIB基因rs6056位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]
表4 DF組不同Wagner分級FIB基因rs6056位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]
圖1 FIB基因rs6056位點(diǎn)3種基因型的波峰圖譜
表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s,g/L)
表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s,g/L)
注:與CC基因型比較,*P<0.05;與 CT基因型比較,#P <0.05
組別FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型DF 組 3.61 ±1.15 4.16 ±1.17* 4.92 ±0.97*#T2DM 組 2.65 ±0.59 2.87 ±0.80 3.43 ±0.98*#正常對照組2.14 ±0.87 2.15 ±0.58 2.54 ±1.17
表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)
表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)
注:與CC基因型比較,*P<0.05
DF患者Wagner分級FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型0 ~ Ⅲ級組 2.99 ±0.79 3.55 ±1.10* 4.07 ±0.53*Ⅳ級組 4.04 ±1.08 4.66 ±0.91 5.29 ±0.73*Ⅴ級組5.63 ±0.30 5.56 ±0.42 5.82 ±0.40
3.單因素Logistic回歸分析 采用非條件Logistic回歸進(jìn)行基因型和等位基因頻率的相對風(fēng)險分析,以疾病分類為因變量,危險因素為自變量。結(jié)果顯示 WBC、FIB、CT基因型和TT基因型、T等位基因?yàn)镈F的危險因素。見表7。
表7 DF組和正常對照組單因素Logistic回歸分析
4.多因素Logistic回歸分析 對以上有差異的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,在校正了WBC和FIB等混雜因素后,發(fā)現(xiàn)TT基因型和T等位基因均不是DF發(fā)生的獨(dú)立危險因素。
DF是T2DM最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。FIB既是一種凝血因子,也是一種炎癥因子。血液中的FIB水平既可以反映血管病變的炎癥過程及內(nèi)皮功能紊亂,又可以直接參與動脈粥樣硬化,是糖尿病血管病變的危險因素。SNP在基因組中的分布相當(dāng)廣泛,SNP堿基位點(diǎn)的改變可導(dǎo)致疾病的易感性,且FIB水平直接受遺傳因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)FIB編碼區(qū)的SNP可以導(dǎo)致FIB結(jié)構(gòu)或功能的異常,且與多種疾病相關(guān)[8]。因此,探討炎癥因子及其SNP與DF的相關(guān)性具有重要意義。
長期的糖脂代謝紊亂損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,刺激各種活性物質(zhì)的釋放,導(dǎo)致凝血功能的紊亂和長期炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示DF組患者FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組,DF WagnerⅤ級患者FIB和WBC水平也顯著高于WagnerⅣ級和Wagner 0~Ⅲ級患者。朱平等[9]的研究顯示,DF潰瘍的發(fā)生與FIB水平密切相關(guān),F(xiàn)IB每增加1個單位,發(fā)生潰瘍的相對危險度增加2.51倍,提示FIB可能是DF潰瘍的一個獨(dú)立危險因素。MESA等[10]發(fā)現(xiàn)DF潰瘍者FIB水平高于DF無足潰瘍者,且FIB水平與DF截肢具有相關(guān)性,降低FIB水平可以降低DF截肢率。由此可見DF患者體內(nèi)存在高炎癥反應(yīng),提示臨床治療中應(yīng)監(jiān)測FIB水平,以達(dá)到預(yù)防的目的。
國外文獻(xiàn)報道,F(xiàn)IB基因rs6056 SNP位點(diǎn)突變可以促進(jìn)FIB水平的升高,且與血栓性疾病有相關(guān)性[4]。但有關(guān)FIB基因rs6056 SNP與DF的相關(guān)性研究目前國內(nèi)外均未見報道。本研究通過對FIB基因rs6056位點(diǎn)SNP與DF的相關(guān)性研究,顯示3組間基因型和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。對基因型和等位基因頻率進(jìn)行Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)TT基因型是DF發(fā)生的遺傳危險因素,以CC基因型攜帶者患DF的風(fēng)險定為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)1,則TT基因型的攜帶者患DF的風(fēng)險增加為5.714,提示 FIB基因rs6056位點(diǎn)SNP與DF的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
本研究觀察了FIB基因rs6056位點(diǎn)對血漿FIB水平的影響,發(fā)現(xiàn)DF組TT基因型的FIB水平均明顯高于CC和CT基因型。FIB基因啟動子區(qū)rs6056位點(diǎn)SNP的變化可能促進(jìn)了FIB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)而增加DF的發(fā)病風(fēng)險。這些研究也從基因水平證實(shí)了炎癥參與了DF的發(fā)生,強(qiáng)調(diào)炎癥在DF發(fā)病中的作用,為DF的抗炎治療提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。本研究進(jìn)一步顯示 DF Wagner分級間基因型和等位基因間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),DF WagnerⅤ級3種基因型間FIB水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示該基因型SNP雖然與DF發(fā)病的易感性有關(guān),但與DF病變程度無相關(guān)性??赡茉?yàn)镕IB作為炎癥因子,其血漿水平受多種因素的影響,除受自身β鏈的遺傳因素影響外,還受其他基因和/或非基因因素如炎癥因子及藥物等的影響。
綜上所述,通過對FIB基因SNP的研究,為進(jìn)一步了解FIB基因位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。由于DF是一種多基因及環(huán)境因素聯(lián)合作用的復(fù)雜疾病,本研究的樣本量較少,故本研究的結(jié)論尚應(yīng)在大樣本中做進(jìn)一步研究,尋找更多的證據(jù)加以驗(yàn)證。
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