趙靜靜，王偉靈，周麗霞，楊沁彤，張 瑩，趙延榮，邢嘉翌

(1.蚌埠醫(yī)學院，安徽蚌埠233030;2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，上海200082;3.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院脈管科，上海200082)

糖尿病足(diabetic foot，DF)是由神經病變、血管病變及感染三者相互作用的結果，而感染是病變加重的重要誘因，約15% ～25%的糖尿病患者會在其一生中發(fā)生足部潰瘍[1]。大量研究表明血管病變和炎癥反應在DF發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[2]。張瑩等[3]研究發(fā)現纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)作為炎癥因子，隨著DF潰瘍嚴重程度的加重而逐漸升高，是DF發(fā)生的獨立危險因素。血漿FIB水平和分子功能的表達主要受遺傳和環(huán)境等因素的影響，其中遺傳是重要的決定因素。大量研究表明FIB β鏈的合成及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)在FIB合成過程中起主要調節(jié)作用。FIB基因啟動子區(qū)rs6056 SNP位于4q32 FGB編碼區(qū)內，與FIB水平的升高具有相關性[4]。目前尚未有該基因SNP與DF相關性的報道。我們探討了FIB水平及FIB基因rs6056 SNP與DF的關系，為預防DF的發(fā)生提供依據。

材料和方法

一、研究對象

隨機選擇2013年1月至2014年3月在上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院脈管科住院的DF患者(DF組)123例，男72例，女51例，年齡(70±11)歲;同期內分泌科住院的無足部潰瘍的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者(T2DM 組)97例，男55例，女42例，年齡(67±9)歲。篩選同期健康體檢者80名作為正常對照組，男46名，女34名，年齡(69±10)歲。糖尿病診斷標準參照美國糖尿病協會2012年發(fā)布的《糖尿病診療標準(2012版)》[5]。DF的診斷標準參照2011年國際DF工作組(International Working Group，IWGDF)發(fā)布的《糖尿病足國際臨床指南》[6]。DF的分級參照Wagner分級方法[7]。

二、病例納入和排除標準

1.納入標準 (1)符合以上診斷標準;(2)正常對照組選擇年齡和性別等與病例組相匹配的，排除高血脂、糖調節(jié)異常及臨床下肢血管病變者;(3)樣本采集過程符合倫理學要求，所有入選者均已簽署知情同意書。

2.排除標準 (1)不符合以上納入標準;(2)近半年內有急性心肌梗死、腦梗死或出血者;(3)合并有嚴重肝、腎功能不全，心力衰竭，血液病，惡性腫瘤等疾病以及精神病患者;(4)存在其它感染性疾病者。

三、臨床資料采集

收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、糖尿病病程及體重指數(body mass index，BMI)等。

四、基因組DNA的提取

抽取入選患者外周靜脈血2 mL，嚴格按照Axy Prep全血基因組DNA試劑盒說明書的操作步驟進行DNA提取。

五、基因多態(tài)性檢測

應用多重聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應法(polymerase chain reaction-ligation detection reaction，PCR-LDR)檢測 FIB基因 rs6056(ID:2244)位點的多態(tài)性。Taq酶體系購自上海翼和應用生物技術有限公司，上、下游引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。上游引物:5'-ACGAAGCACACGAAGGTTAG-3'，下游引物:5'-CTCAGAACTGGAAAAGCACC-3'。

1.PCR反應體系 總體系為20μL。1×PCR緩沖液2μL，3 mmol/L Mg2+0.6μL，2 mmol/each dNTP 2μL，1 U Taq 酶 0.2μL，ddH2O 12.2μL，0.5 pmol上、下游引物模板各1μL。多重 PCR反應條件:95℃預變性2 min;94 ℃變性90 s，50 ℃退火90 s，65 ℃延伸30 s，循環(huán)40次;65℃再延伸10 min終止反應。以上反應在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴增儀上進行。反應結束后，取2μL反應產物在3%瓊脂糖膠、0.5×TBE中電泳，檢測反應的特異性。剩余樣本保存于-20℃。

2.PCR產物的連接酶檢測反應體系 總體系為10μL。1×PCR 緩沖液 1μL，probe mix(each)1μL，Taq DNA 連接酶0.05μL，ddH2O 4μL，PCR產物4μL。95 ℃變性2 min，94 ℃延伸15 s，50 ℃退火25 s，循環(huán)40次。以上反應在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因擴增儀上進行。

3.基因測序 取多重PCR-LDR產物1μL，加1μL ABI GS-500 ROX熒光標記分子量標準和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，進行電泳，在3730XL DNA Analyzer測序儀(Applied Biosystems/HITACHI，ABI)上進行測序。應用Genemapper軟件進行數據分析和基因分型。

六、實驗室其他指標的檢測

FIB采用CAI500全自動血凝儀(日本Sysmex公司)及 Dade Behring公司試劑檢測;白細胞(white blood cell，WBC)計數采用 SYSMEX XE-2100全自動血液分析儀及配套試劑檢測(日本Sysmex公司);空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)、餐后2 h血糖(2 hour postprandial blood glucose，2 hPG)使用Roche公司試劑(葡萄糖氧化酶比色法)，在HITACHI 7600-020全自動生化分析儀(日本日立公司)上測定，糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C，HbA1C)采用D-10糖化血紅蛋白分析儀(Bio-Rad公司)檢測，所有操作均嚴格按照說明書進行。

七、統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析?；蛐?、等位基因頻率及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測采用 SHEsis(http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析。如符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，則表明研究對象是來自同一群體，具有較好的代表性。各組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以野生型純合子CC作為對照，采用非條件Logistic回歸計算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，用以說明不同基因型和等位基因與DF的發(fā)病風險。符合正態(tài)分布的數據采用±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，方差齊性資料采用LSD檢驗，方差不齊資料采用Tamhane’s T2(M)檢驗。計數資料用率或構成比表示，采用χ2檢驗進行統計推斷。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、3組間基本資料的比較

DF組WBC和FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組(P＜0.05)，DF組病程較T2DM組長(P＜0.05)。3組間年齡及性別構成差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)

表1 DF組、T2DM組及正常對照組基線資料的比較 (±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05;與 T2DM 組比較，#P ＜0.05

組別 例數 年齡(歲) 病程(年) FPG(mmol/L) WBC(×109/L) FIB(g/L)DF 組 123 70 ±11 14.72 ±8.32# 8.06 ±3.82* 8.31 ±6.84*# 3.95 ±1.20*#T2DM 組 97 67 ±9 10.11 ±7.73 8.44 ±3.79* 6.38 ±1.65 2.81 ±0.75*正常對照組80 69 ±10 - 5.47 ±0.48 5.83 ±1.53 2.15 ±0.81

二、DF組不同Wagner分級相關指標的比較

根據Wagner分級將DF組分為0～Ⅲ級(57例，男33例、女24例)、Ⅳ級(56例，男33例、女23例)、Ⅴ級(10例，男6例、女4例)。WagnerⅤ級患者WBC和FIB水平均明顯高于WagnerⅣ級和Wagner 0～Ⅲ級患者(P均＜0.05);3組間年齡、病程及 BMI差異均無統計學意義(P均 ＞0.05)。見表2。

表2 DF組不同Wagner分級相關指標的比較 (±s)

表2 DF組不同Wagner分級相關指標的比較 (±s)

注:與0～Ⅲ級組比較，*P ＜0.05;與Ⅳ級組比較，#P ＜0.05

Wagner分級 例數 年齡(歲) 病程(年) BMI(kg/m2) WBC(109/L) FIB(g/L)8 ±0.95Ⅳ級組 56 70 ±12 14.50 ±8.26 23.54 ±4.64 8.88 ±9.43* 4.33 ±1.08*Ⅴ級組 10 66 ±12 16.30 ±7.86 21.18 ±3.55 13.56 ±3.90*# 5.63 ±0.36*#0 ～ Ⅲ級組 57 70 ±11 14.63 ±8.59 23.29 ±3.57 6.81 ±1.98 3.2

三、FIB基因rs6056位點基因型及等位基因的判斷

1.FIB基因rs6056位點基因型及等位基因頻率分布 經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測，各組樣本間rs6056位點基因型及等位基因頻率分布均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2=0.102、0.546、0.595，P ＞0.05)，具有群體代表性。DF 組及T2DM組基因型及等位基因頻率分布與正常對照組比較差異均有統計學意義(P均＜0.01)。DF組Wagner不同分級間基因型及等位基因分布差異均無統計學意義(P均＞0.05)。見表3、表4及圖1。

2.不同基因型間FIB水平比較 DF組TT基因型FIB水平明顯高于CC和CT基因型(P＜0.05);T2DM組TT基因型 FIB水平高于CC和CT基因型(P＜0.05)，而CC和CT基因型之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表5。DF患者中Wagner 0～Ⅲ級組TT和CT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P＜0.05)，WagnerⅣ級組TT基因型的FIB水平明顯高于CC基因型(P＜0.05)。正常對照組及 DF組 WagnerⅤ級3種基因型間比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。 見表6。

表3 DF組、T2DM組及正常對照組FIB基因rs6056位點基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]

表4 DF組不同Wagner分級FIB基因rs6056位點基因型和等位基因頻率分布的比較 [例(%)]

圖1 FIB基因rs6056位點3種基因型的波峰圖譜

表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s，g/L)

表5 DF組、T2DM組及正常對照組不同基因型之間血漿FIB水平的比較 (±s，g/L)

注:與CC基因型比較，*P＜0.05;與 CT基因型比較，#P ＜0.05

組別FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型DF 組 3.61 ±1.15 4.16 ±1.17* 4.92 ±0.97*#T2DM 組 2.65 ±0.59 2.87 ±0.80 3.43 ±0.98*#正常對照組2.14 ±0.87 2.15 ±0.58 2.54 ±1.17

表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)

表6 DF患者不同Wagner分級3種基因型之間血漿FIB水平的比較 (g/L±s)

注:與CC基因型比較，*P＜0.05

DF患者Wagner分級FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型0 ～ Ⅲ級組 2.99 ±0.79 3.55 ±1.10* 4.07 ±0.53*Ⅳ級組 4.04 ±1.08 4.66 ±0.91 5.29 ±0.73*Ⅴ級組5.63 ±0.30 5.56 ±0.42 5.82 ±0.40

3.單因素Logistic回歸分析 采用非條件Logistic回歸進行基因型和等位基因頻率的相對風險分析，以疾病分類為因變量，危險因素為自變量。結果顯示 WBC、FIB、CT基因型和TT基因型、T等位基因為DF的危險因素。見表7。

表7 DF組和正常對照組單因素Logistic回歸分析

4.多因素Logistic回歸分析 對以上有差異的指標進行多因素Logistic回歸分析，在校正了WBC和FIB等混雜因素后，發(fā)現TT基因型和T等位基因均不是DF發(fā)生的獨立危險因素。

討 論

DF是T2DM最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。FIB既是一種凝血因子，也是一種炎癥因子。血液中的FIB水平既可以反映血管病變的炎癥過程及內皮功能紊亂，又可以直接參與動脈粥樣硬化，是糖尿病血管病變的危險因素。SNP在基因組中的分布相當廣泛，SNP堿基位點的改變可導致疾病的易感性，且FIB水平直接受遺傳因素的影響。有研究發(fā)現FIB編碼區(qū)的SNP可以導致FIB結構或功能的異常，且與多種疾病相關[8]。因此，探討炎癥因子及其SNP與DF的相關性具有重要意義。

長期的糖脂代謝紊亂損害血管內皮細胞的功能，刺激各種活性物質的釋放，導致凝血功能的紊亂和長期炎癥反應。本研究結果顯示DF組患者FIB水平明顯高于T2DM組和正常對照組，DF WagnerⅤ級患者FIB和WBC水平也顯著高于WagnerⅣ級和Wagner 0～Ⅲ級患者。朱平等[9]的研究顯示，DF潰瘍的發(fā)生與FIB水平密切相關，FIB每增加1個單位，發(fā)生潰瘍的相對危險度增加2.51倍，提示FIB可能是DF潰瘍的一個獨立危險因素。MESA等[10]發(fā)現DF潰瘍者FIB水平高于DF無足潰瘍者，且FIB水平與DF截肢具有相關性，降低FIB水平可以降低DF截肢率。由此可見DF患者體內存在高炎癥反應，提示臨床治療中應監(jiān)測FIB水平，以達到預防的目的。

國外文獻報道，FIB基因rs6056 SNP位點突變可以促進FIB水平的升高，且與血栓性疾病有相關性[4]。但有關FIB基因rs6056 SNP與DF的相關性研究目前國內外均未見報道。本研究通過對FIB基因rs6056位點SNP與DF的相關性研究，顯示3組間基因型和等位基因頻率分布差異均有統計學意義(P均＜0.01)。對基因型和等位基因頻率進行Logistic回歸分析，發(fā)現TT基因型是DF發(fā)生的遺傳危險因素，以CC基因型攜帶者患DF的風險定為標準數1，則TT基因型的攜帶者患DF的風險增加為5.714，提示 FIB基因rs6056位點SNP與DF的發(fā)生、發(fā)展有關。

本研究觀察了FIB基因rs6056位點對血漿FIB水平的影響，發(fā)現DF組TT基因型的FIB水平均明顯高于CC和CT基因型。FIB基因啟動子區(qū)rs6056位點SNP的變化可能促進了FIB的轉錄和表達，進而增加DF的發(fā)病風險。這些研究也從基因水平證實了炎癥參與了DF的發(fā)生，強調炎癥在DF發(fā)病中的作用，為DF的抗炎治療提供循證醫(yī)學依據。本研究進一步顯示 DF Wagner分級間基因型和等位基因間差異無統計學意義(P＞0.05)，DF WagnerⅤ級3種基因型間FIB水平差異無統計學意義(P＞0.05)，提示該基因型SNP雖然與DF發(fā)病的易感性有關，但與DF病變程度無相關性?？赡茉驗镕IB作為炎癥因子，其血漿水平受多種因素的影響，除受自身β鏈的遺傳因素影響外，還受其他基因和/或非基因因素如炎癥因子及藥物等的影響。

綜上所述，通過對FIB基因SNP的研究，為進一步了解FIB基因位點與疾病的相關性奠定基礎。由于DF是一種多基因及環(huán)境因素聯合作用的復雜疾病，本研究的樣本量較少，故本研究的結論尚應在大樣本中做進一步研究，尋找更多的證據加以驗證。

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