鄒繼紅，王洪斌，趙春杰

（1.赤峰學院 醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰市傳染病防治醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016）

蒙藥伊赫烏蘭-13由土木香、苦參、梔子、茜草、懸鉤子木、山柰、訶子、川楝子、枇杷葉、紫草茸、橡子、紫草、金蓮花組成，具有清血熱之功效，臨床上主要用于頭痛、血熱上盛、目赤、高血壓等病癥[1].對于方中主藥苦參中苦參堿的含量測定，作者未見其他文獻報道，為了合理有效控制該制劑的內(nèi)在質量，作者參考部分相關文獻，以苦參的活性成分苦參堿作為測定指標，采用HPLC測定其含量，經(jīng)過方法學考察證明該方法操作簡便，重現(xiàn)性良好，專屬性較強，方中其它組分對苦參堿的測定無干擾，可作為伊赫烏蘭-13的質量控制方法.

1 試劑與儀器

1.1 試劑

苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110805-201401）；用于配制流動相的甲醇和乙腈均為色譜純，用于提取樣品的甲醇為分析純，磷酸、氨水、三氯甲烷、無水乙醇與三乙胺為分析純；娃哈哈純凈水.蒙藥伊赫烏蘭-13（內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，批號：20140107，20140502，20140706）；陰性對照品的藥材（購自內(nèi)蒙古赤峰市中蒙醫(yī)院）.

1.2 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；KQ-250E型超聲波清洗器；METTLER AE240電子天平；UV765紫外可見分光光度計；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋；pHS-3C酸度計.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack C18色譜柱 (250mm×4.6mm，內(nèi)徑5μm)，柱溫為室溫，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸=6∶10∶9（用三乙胺調(diào)節(jié)pH為7.2），檢測波長為210nm，流速為1.0mL·min-1，進樣體積為20μL.

2.2 溶液的制備

2.2.1 苦參堿對照品溶液的配制

取10.5mg苦參堿對照品，精密稱定，置25mL量瓶中，加流動相適量使之溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得到420μg·mL-1的苦參堿對照品貯備液.精密吸取該貯備液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mL，分別置10mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，得到一系列苦參堿的對照品溶液.

2.2.2 供試品溶液的制備

取研細的伊赫烏蘭-13細粉5.0g，精密稱定，置于250mL具塞錐形瓶中，加入氨水5mL使?jié)櫇瘢偌訜o水乙醇50mL，密塞，超聲處理30min，放冷，濾過，濾器與容器用無水乙醇20mL分4次洗滌，合并洗液與濾液，水浴蒸干，殘渣用無水乙醇溶解，定容至10mL，搖勻.用0.45μm微孔濾膜濾過，制得供試品溶液.

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

按處方要求制備不含苦參堿藥材的樣品，同法制成陰性樣品溶液，濾過.

2.3 專屬性測試

圖1 陰性樣品、苦參堿對照品和供試品的HPLC圖A.陰性樣品；B.對照品；C.供試品；1-苦參堿

取陰性樣品溶液、苦參堿對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件，分別進樣20μL，測定，色譜圖如圖1所示.由圖可知：苦參堿的保留時間約7.2min，陰性樣品對苦參堿的測定無干擾，苦參堿與其他組分可達到基線分離.

2.4 線性范圍的測試

分別精密吸取系列苦參堿對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，苦參堿的濃度(μg·mL-1)為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程為：Y=46.003X–1.206，（r=0.9999）.結果表明：苦參堿的濃度在 8.4μg·mL-1～84μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性.

2.5 精密度測試

精密吸取50.4μg·mL-1的苦參堿對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，重復6次，對照品的RSD=0.4%，樣品的RSD=1.2%，結果表明儀器的精密度良好.

2.6 穩(wěn)定性測試

精密吸取同一份供試品溶液，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、10h，注入色譜儀，測定峰面積.苦參堿峰面積的RSD=1.3%，結果表明供試品溶液在10h內(nèi)保持穩(wěn)定.

2.7 重復性測試

精密稱取同一批樣品（批號：20140903），按“2.2”項下的方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項的色譜條件進樣測定.樣品中苦參堿的平均含量為0.085mg·g-1，RSD=1.1%，結果表明方法的重復性良好.

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取4.0g已知苦參堿含量的同一批 (批號：20140903，含量為0.085mg·g-1)樣品粉末9份，分別精密加入 210μg·mL-1的苦參堿對照品溶液 1.6、1.8和 2.0mL，按“2.2”項方法處理，精密吸取20μL，注入色譜儀，測定峰面積，計算苦參堿的回收率，結果見表1.

表1 加樣回收率試驗數(shù)據(jù)（n=9）

2.9 樣品測定

取3個批號的樣品，按“2.2”項方法處理后，精密吸取供試品溶液和苦參堿對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，外標法計算苦參堿的含量，結果見表2.

表2 樣品測定數(shù)據(jù)（n=3）

3 討論

采用UV-765紫外-可見分光光度計掃描苦參堿對照品溶液的紫外吸收光譜，苦參堿的最大吸收波長為210nm，故測定時選取210nm為測定波長.在篩選流動相的過程中，參考相關文獻嘗試采用甲醇-水-四氫呋喃[2-4]、甲醇-0.1%磷酸溶液[5-6]等作為流動相，但苦參堿的色譜峰嚴重拖尾.經(jīng)多次試驗，最后當采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸=10∶6∶9（用三乙胺調(diào)pH為7.2）時，苦參堿的拖尾因子合格，與其他組分分離良好，而且流動相的組成簡單，容易配制.實驗過程中將無水乙醇、甲醇和三氯甲烷提取后樣品中苦參堿的含量進行對比，結果發(fā)現(xiàn)無水乙醇的提取率高，雜質峰少，分離度合格，且試劑的毒性低，所以最終采用無水乙醇為提取溶劑.

此外，還測定了超聲提取20、30和40min的樣品，結果發(fā)現(xiàn)提取30min和40min的樣品中苦參堿的含量比較接近，所以最終采用超聲30min.

〔1〕中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊[S].1998.73.

〔2〕李雨生.烏蘭十味散中苦參堿的含量測定[J].北方藥學，2010，7（2）：41-42.

〔3〕周桂坤，莫日根高娃，哈斯高娃，等.RP-HPLC法測定烏蘭三味湯散中苦參堿的含量[J].中國藥事，2003，17（10）：624-626.

〔4〕李麗.HPLC法測定蒙藥烏蘭三味湯散劑中茜草素含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2012(6)：51-52.

〔5〕姜哲，孫良鵬，許紅蘭.反相高效液相色譜法測定不同地區(qū)不同采集期茜草中茜草素的含量 [J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）：1719-1720.

〔6〕張寧，楊曉宏，馬曉帆.HPLC法測定十三味菥蓂膠囊中苦參堿的含量 [J]. 藥物分析雜志，2007，27 （9）：1475-1477.