李能蓮，張立，張秋菊，李長天，舍雅莉，駱亞莉

（甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

BNIP3表達載體轉(zhuǎn)染對胃癌細胞株SGC-7901生物學行為的影響

李能蓮，張立，張秋菊，李長天，舍雅莉，駱亞莉

（甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

目的觀察BcL-2與腺病毒E1B 19KDa相互作用蛋白3（BNIP3）高表達對胃癌細胞SGC-7901的增殖以及對化療藥物敏感性的影響。方法免疫細胞化學法篩選BNIP3表達陰性或表達相對較低的胃癌細胞株；BNIP3真核表達載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌細胞；Western blot進行鑒定；MTT法和克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖情況；MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞對常規(guī)化療藥5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性。結(jié)果SGC-7901和BGC-823細胞均有BNIP3表達，表達水平SGC-7901低于BGC-823（P＜0.05）；與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BNIP3-FLAG組BNIP3相對表達量顯著增高（P＜0.05），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BNIP3-FLAG組5-Fu的IC50值顯著降低（P＜0.05），細胞克隆形成率顯著降低（P＜0.05），細胞增殖速度減慢。結(jié)論BNIP3在胃癌細胞中高表達可抑制胃癌細胞SGC-7901增殖，增強細胞對化療藥物5-Fu的敏感性。

BNIP3；胃癌；SGC-7901；轉(zhuǎn)染

分子靶向治療已成為當前腫瘤治療研究的熱點。Bcl-2與腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3（bc1-2／adenovirus E1B 19kDa interacting protein3，BNIP3）是Bcl-2家族促凋亡蛋白。許多研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌[1]和一些造血系統(tǒng)[2]、結(jié)腸直腸[3]、胃[4]部惡性腫瘤中BNIP3表達下調(diào)，且與腫瘤的不良預后有關(guān)。我們在前期研究中也已經(jīng)證實，BNIP3在胃癌組織中表達下調(diào)，致使瘤細胞得以生存[5，6]，提示BNIP3低表達或失活在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。如果BNIP3恢復表達或使其過表達，則有可能促進腫瘤細胞凋亡，還可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。本實驗擬通過篩選BNIP3表達相對較低的胃癌細胞株，應(yīng)用BNIP3表達載體轉(zhuǎn)染以增強BNIP3的表達，觀察腫瘤細胞生物學行為的變化（如增殖、凋亡等），探討以BNIP3為靶點治療胃癌的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901，BGC-823（甘肅中醫(yī)學院實驗中心提供），RPMI1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司），小牛血清（杭州四季清公司），BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天公司），BNIP3鼠抗人單克隆抗體（英國Abcam公司），羊抗鼠IgG、鼠單抗β-actin（美國Sigma公司），二甲基四氮唑藍（MTT，美國Sigma公司），5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸公司），SP-免疫細胞化學試劑盒（北京中杉金橋公司），G418（德國Merk公司），陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），BNIP3表達載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG（美國匹茲堡大學艾軍魁博士構(gòu)建并惠贈，pcDNA3.1質(zhì)粒具有新霉素抗性基因）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)分別將人胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823培養(yǎng)于RPMI1640細胞培養(yǎng)液，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫細胞化學將對數(shù)生長期的SGC-7901、BGC-823細胞分別接種12孔板進行細胞爬片，按免疫細胞化學試劑盒說明書常規(guī)檢測BNIP3在兩種細胞中的表達。染色結(jié)果用計算機圖像分析系統(tǒng)分析，選取BNIP3表達水平相對較低的細胞株進行下一步實驗。

1.2.3 G418篩選濃度的確定將SGC-7901單細胞懸液接種于24孔板，G418按0、100～1 100 μg/ml的終濃度依次加入各孔中，各濃度設(shè)復孔，觀察細胞的生長狀況，以第10天細胞全部死亡的最低濃度為G418的篩選濃度。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)染實驗分3組：BNIP3表達載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG轉(zhuǎn)染組、空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組。按LipofectamineTM2000試劑盒中的說明書進行轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的各組細胞分別命名為SGC-7901-BNIP3+、SGC-7901-neo、SGC-7901。

1.2.5 Western blot檢測BNIP3的表達蛋白提取和蛋白濃度測定按試劑盒說明書進行，Western blot檢測按常規(guī)操作程序進行，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，一抗為鼠抗人BNIP3單克隆抗體（1∶800），二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG（1∶5 000），DAB顯色，β－actin為內(nèi)參照。晾干的NC膜用Mcrotec scanMaker E6系統(tǒng)掃描，Quantity One4．1圖像分析軟件測定各顯色條帶的積分吸光度D值，以目的蛋白/β－actin吸光度值表示。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖將制成單細胞懸液的各組細胞，接種于96孔板，每組設(shè)6個復孔，培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時，MTT法常規(guī)染色，酶標儀檢測波長490 nm處的光密度D（490）值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，每組平均D（490）值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.2.7 平板克隆形成試驗檢測細胞增殖將生長旺盛的各組細胞分別接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿，每組設(shè)3個平行皿，每皿依次含50、100、200個細胞，常規(guī)培養(yǎng)兩周，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng)。乙醇固定，姬姆薩染色。將干燥后的培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)，計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)÷接種細胞數(shù)×100%。

1.2.8 MTT法檢測各組細胞對5-Fu的敏感性SGC－7901細胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3．1或重組質(zhì)粒pcDNA3．1－BNIP3－FLAG 48 h后，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組加入不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 μg/ml）的5－Fu，每個濃度設(shè)3個復孔，并設(shè)空白對照孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后MTT法染色，酶標儀檢測D（490）值。計算藥物的細胞增殖抑制率，采用LOGIT法計算化療藥物IC50值。抑制率=[1－實驗孔平均D（490）值÷對照孔平均D（490）值]×100%。

1.2.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，P＜0．05為差異有顯著性。

圖1 BNIP3在不同細胞質(zhì)中的表達

2.1 免疫細胞化學

胃癌細胞SGC－7901、BGC－823的細胞質(zhì)中均可見BNIP3表達，表達水平（A值）SGC－7901（0．164±0．233）明顯低于BGC－823（0．392±0．163），P＜0．05，見圖1。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

各組細胞經(jīng)G418（篩選最低濃度為600 μg/ml）加壓篩選8周后，BINP3表達載體pcDNA3．1－BNIP3－FLAG轉(zhuǎn)染組和空載體pcDNA3．1轉(zhuǎn)染組可見細胞克隆生長，而非轉(zhuǎn)染組細胞全部死亡，細胞轉(zhuǎn)染成功。

2.3 Western blot檢測各組細胞中BNIP3表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+組的BNIP3相對表達量分別為：（0．216± 0．067）、（0．279±0．012）、（0．974±0．005）。后者較前兩組顯著升高（P＜0．05），前兩組之間差異無顯著性（P＞0．05）。

2.4 MTT檢測5-Fu敏感性

SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+各組細胞5－Fu的IC50值分別為（60．13±3．44）、（53．40±3．71）、（26．08±1．68）μg/ml。與前兩組比較，SGC－7901－BNIP3+組細胞5－Fu的IC50值顯著降低（P＜0．05）。

2.5 MTT法繪制細胞生長曲線

MTT法連續(xù)5 d檢測各組細胞增殖情況，結(jié)果表明，SGC－7901－BNIP3+組細胞增殖能力明顯低于SGC－7901－neo組和SGC－7901組（P＜0．05）。后兩組間細胞增殖能力差異無顯著性（P＞0．05），見圖2。

2.6 平板克隆形成

SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+組的克隆形成率分別為（29．20±2．48）%、（17．90±1．83）%、（10．07±1．33）%，前兩組明顯高于第三組（P＜0．05），前兩組間差異無顯著性（P＞0．05)，見圖3。

圖2 各組細胞生長曲線

圖3 各組克隆形成觀察（接種細胞數(shù)：200個/皿）

2 結(jié)果

3 討論

BNIP3是在酵母蛋白雙雜交篩選中被發(fā)現(xiàn)的能與腺病毒E1B19kDa（一個Bcl-2的同系物）相互作用的促凋亡蛋白。在生理條件下，BNIP3低水平表達在骨骼肌和腦組織中[7]，但在低氧條件下，BNIP3可以通過HIF信號通路被誘導表達，導致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，PTP）開放，消除質(zhì)子電化學梯度，引起染色質(zhì)凝聚，DNA損傷[8]，從而誘導細胞凋亡。我們在前期研究中已經(jīng)證實，BNIP3是HIF-1α的靶基因，而且在胃癌的發(fā)生過程中，BNIP3誘導表達屬早期事件，一旦腫瘤發(fā)生，BNIP3在癌組織中的表達就會受到抑制（如被EGF、IGF等抑制[9]）。

本實驗通過轉(zhuǎn)基因法，使低表達BNIP3的胃癌SGC-7901細胞恢復BNIP3表達或過表達，則SGC-7901細胞增殖能力顯著降低，BNIP3高表達可以增加癌細胞對5-Fu的敏感性，說明化療藥物的增敏與BNIP3促進SGC-7901細胞的凋亡、抑制細胞增殖有關(guān)。這些結(jié)果提示，BNIP3表達下調(diào)致使胃癌細胞逃避低氧誘導的凋亡反應(yīng)，可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件之一，BNIP3有可能成為靶向性藥物攻擊的重要環(huán)節(jié)。因此，對BNIP3在腫瘤中作用機制的進一步研究，將有助于建立個性化的腫瘤治療方法。

[1]Erkan M，Kleeff J，Esposito I，et al.Loss of BNIP3 expression is alate event inpancreatic cancer contributing to chemoresistance and worsened prognosis[J].Oncogene，2005，24（27）：4421-4432.

[2]Valdez B C，Murray D，Ramdas L，et al．Altered gene expression in busulfan-resistant human myeloid leukemia[J]．Leuk Res，2008，32（11）：1684-1697．

[3]Tang H，Liu Y J，Liu M，et al．Establishment and gene analysis of an oxaliplatin-resistant colon cancer cell line THC8307/L-OHP[J]．Anticancer Drugs，2007，18（6）：633－639．

[4]Murai M，Toyota M，Suzuki H，et al.Aberrant methylation and silencing of the BNIP3 gene in colorectal and gastric cancer[J].ClinCancerRes，2005，11（3）：1021-1027．

[5]李能蓮，張煦，樊平，等.BNip3在胃癌中的表達及意義[J].蘭州大學學報：醫(yī)學版，2007，33（1）：40-42.

[6]李能蓮，張煦.缺氧誘導因子及其應(yīng)答基因BNIP3和血管內(nèi)皮生長因子在胃腺癌中的表達及臨床意義[J].中華腫瘤雜志，2008，30（1）：44-47.

[7]Teralee R，Burton，Elizabeth S，et al.The pro-cell death Bcl-2 family member，BNIP3，is localized to the nucleus of human glial cells：Implications for glioblastoma multiforme tumor cell survival under hypoxia Int[J]. Cancer，2006（118）：1660-1669.

[8]Masanori Akada.Intrinsic chemoresistance to gemcitabine is associated with decreased expression of BNIP3 in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res，2005，11（8）：3094-3101.

[9]Shilpa Kothari，Jeannick Cizeau，Eileen McMillan-Ward，et al.BNIP3 plays a role in hypoxic cell death in human epithelial cells that is inhibited by growth factors EGF and IGF[J].Oncogene，2003（22）：4734-4744.

R730.23

B

1671-1246（2015）05-0105-03

注：本文系2010年甘肅省教育廳第二批科研計劃項目（1006B-09）；2011年蘭州市科技局第二批計劃項目（BH2011-082）