陳 欣，楊 倩，張平冬，康向陽

（北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國家工程實驗室 林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實驗室，北京100083）

減數(shù)分裂是生物有性生殖的重要過程，是遺傳重組和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞遺傳學(xué)和生殖生物學(xué)領(lǐng)域長久不衰的研究課題［1-2］。在植物界，減數(shù)分裂需經(jīng)歷染色體復(fù)制、同源染色體聯(lián)會、染色體片段交換、同源染色體分離、姊妹染色體單體分離以及細(xì)胞質(zhì)分裂等一系列復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，并最終形成大量具有活力的小孢子，參與有性生殖過程?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)研究表明，植物減數(shù)分裂是一個多基因在減數(shù)分裂不同時期和花器不同部位參與表達(dá)的精細(xì)過程，其中任何過程出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致花粉產(chǎn)生變異，甚至?xí)率剐℃咦訑∮?/p>

胡楊（Populus euphratica）是我國西部干旱荒漠地區(qū)內(nèi)陸河流域兩岸天然分布的喬木樹種之一，具有耐鹽堿［3］、抗干旱等優(yōu)良特性，在維護(hù)分布區(qū)內(nèi)的生態(tài)平衡、保障綠洲區(qū)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和為居民提供木材等方面發(fā)揮著重要作用［4］，具有一定的育種價值。由于其無性繁殖困難，與楊屬內(nèi)其他派間樹種雜交可配性差，嚴(yán)重制約了胡楊良種選育研究的進(jìn)程［5］。20世紀(jì)80年代，李文鈿［6］等對胡楊小孢子母細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育開展了初步研究。張平冬［7］等利用醋酸洋紅壓片法和間接免疫熒光法，對胡楊小孢子發(fā)生過程中的微管骨架動態(tài)變化和染色體行為進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)胡楊花粉中存在未減數(shù)2n花粉。至今還未見胡楊減數(shù)分裂進(jìn)程與花芽外部形態(tài)、花藥顏色以及花粉變異間相關(guān)關(guān)系的報道。本文利用醋酸洋紅壓片法對胡楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程與花芽外部形態(tài)以及花藥顏色變化的關(guān)系、花粉形態(tài)多樣性等開展了研究。該研究有助于理解楊屬派間減數(shù)分裂行為差異和特異現(xiàn)象以及減數(shù)分裂異常與花粉變異的關(guān)系，為胡楊良種選育策略的制定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2011年12月中旬，課題組成員去往內(nèi)蒙古自治區(qū)額濟(jì)納旗東河烏蘭圖格地區(qū)的胡楊天然林進(jìn)行胡楊雄花枝采集。胡楊雄性樣株的選取采用隨機(jī)抽樣法抽取，共計抽取了18個雄性樣株。為了保證每樣株屬于不同的基因型，抽樣時每樣株間的間距至少50m以上。分單株采集花枝，塑料布包裹后快遞運(yùn)回北京林業(yè)大學(xué)。

1.2 試驗方法

2011年12月底，將胡楊雄花枝移入北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室溫室進(jìn)行切枝水培，培養(yǎng)溫度控制10～20℃。每隔3～4h隨機(jī)摘取2～3個雄花芽，經(jīng)卡諾固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）固定后，利用醋酸洋紅染色法制作臨時壓片，即時判別小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期。待小孢子母細(xì)胞發(fā)育至細(xì)線期時，每隔2h固定1次，每次固定3～5個花芽，直至花藥成熟散粉為止。胡楊花藥在-4℃的冰箱固定24h后，轉(zhuǎn)移至70%的酒精中保存待用。

采用醋酸洋紅染色壓片法觀察小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為，永久制片參考康向陽［8］的方法：取經(jīng)卡諾固定液充分固定的胡楊雄花芽，摘取中部小花，去除花盤后放置在潔凈的載玻片上，滴加4、5滴醋酸洋紅，用尖嘴鑷子夾碎花藥制作涂片，經(jīng)火焰干燥后進(jìn)行鏡檢、照相。

收集胡楊成熟花粉，經(jīng)醋酸洋紅染色后，放置于Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，并采用O-lympus DP70顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)碼拍照，花粉粒直徑測量以及天然2n花粉比率的統(tǒng)計。每基因型測量2 000個以上的花粉粒。直徑超過其平均值1.28倍的花粉粒被視為2n花粉［9］。2n花粉頻率為2n花粉占觀察花粉?？倲?shù)的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡楊減數(shù)分裂進(jìn)程與雄花芽外部形態(tài)變化的對應(yīng)關(guān)系

胡楊減數(shù)分裂進(jìn)程與雄花芽外部形態(tài)及花藥顏色變化存在明顯的對應(yīng)關(guān)系（表1）。溫室條件下水培至288h，小孢子母細(xì)胞進(jìn)入第1次減數(shù)分裂前期，此時雄花芽略微膨大，花藥顏色為嫩綠色（圖1，A-B）；隨后，花芽進(jìn)一步膨大，芽鱗出現(xiàn)微裂，花藥顏色由微黃色轉(zhuǎn)變成微紅色（圖1，C-H），小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂由中期Ⅰ發(fā)育至末期Ⅱ。水培至316h，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)入四分體時期，花芽仍在繼續(xù)膨大，芽鱗裂口增大，花藥顏色由微紅色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\紅色（圖1，I-J）。

表1 胡楊減數(shù)分裂進(jìn)程與雄花芽形態(tài)以及花藥顏色變化的對應(yīng)關(guān)系Table 1 Relationship between meiotic stage of microspore mother cell and shapes of flower bud and anther color in Populus euphratica

2.2 胡楊減數(shù)分裂染色體行為觀察

胡楊雄花枝經(jīng)歷約288h的水培后，小孢子母細(xì)胞發(fā)育至細(xì)線期，此時可觀察到2個正在融合的核仁，一個大核仁和一個小核仁，染色體呈細(xì)線狀，聚集成團(tuán)，偏在核仁的一側(cè)（圖2-1）；偶線期，染色體縮短變粗，同源染色體相互靠近，開始出現(xiàn)聯(lián)會現(xiàn)象，2個核仁依然清晰可見（圖2-2）；粗線期，同源染色體聯(lián)會結(jié)束，形成四合體，染色體明顯變粗，核仁融合結(jié)束，形成一個核仁（圖2-3）；進(jìn)入雙線期后，四合體繼續(xù)縮短變粗，同源染色體開始部分分離（圖2-4），單價體偶爾可見，可觀察到3對同源染色體與核仁相連（圖2-5）；終變期，染色體進(jìn)一步縮短，呈顆粒狀，核仁變小直至消失，是染色體計數(shù)最佳時期之一（圖2-6）。緊接著，減數(shù)分裂進(jìn)入中期Ⅰ，此時核仁完全消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紡錘體，四合體逐漸移向赤道板，并整齊地定位于赤道板中央（圖2-7），單價體清晰可見（圖2-8）；后期Ⅰ，由于紡錘體牽引，同源染色體逐步分離，向細(xì)胞兩極移動（圖2-9），常伴隨有落后染色體，滯留在赤道板中央（圖2-10）；同源染色體抵達(dá)到細(xì)胞兩極后，減數(shù)分裂進(jìn)入末期Ⅰ（圖2-11），此時染色體開始解螺旋，核仁重現(xiàn)（圖2-12），每子核最多可見8個小核仁（圖2-13），染色體恢復(fù)成線狀，難以染色觀察，標(biāo)志著減數(shù)第一次分裂結(jié)束。

隨著小核仁融合，染色體又一次縮短變粗，外形呈“X”型，表明減數(shù)分裂已進(jìn)入前期Ⅱ（圖2-14）；至中期Ⅱ，核仁消失，染色體移向子細(xì)胞的赤道板中央，出現(xiàn)紡錘體，可以看見平行紡錘體（圖2-15）、三極紡錘體（圖2-16）以及融合紡錘體（圖2-17）3種形態(tài)，偶爾還可看見減數(shù)分裂中期Ⅱ的不同步現(xiàn)象，其中一子細(xì)胞的染色體已表現(xiàn)出中期Ⅱ的特征，而另一子細(xì)胞的染色體還停留在晚前期Ⅱ（圖2-18）；后期Ⅱ，姊妹染色單體在紡錘體的牽引下彼此分離，移向子細(xì)胞的兩極（圖2-19），也能看見落后染色體（圖2-20）；分離的姊妹染色單體抵達(dá)子細(xì)胞的兩極后，減數(shù)分裂進(jìn)入末期Ⅱ（圖2-21），此時姊妹染色體單體進(jìn)行解螺旋，核膜核仁重新出現(xiàn)，標(biāo)志著第二次減數(shù)分裂結(jié)束。與末期Ⅰ相似，末期Ⅱ也可觀察到多核仁現(xiàn)象（圖2-22），且每一子核內(nèi)最多能觀察到4個核仁。一般來說，小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂會形成四分孢子，即四分體（圖2-23）。但由于減數(shù)分裂中期Ⅱ紡錘體定位異常和胞質(zhì)分裂異常的發(fā)生，通?？捎^察到三分體（圖2-24）和二分體（圖2-25）的存在。

2.3 胡楊花粉形態(tài)多樣性

小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的直接產(chǎn)物就是花粉。由于胡楊減數(shù)分裂Ⅱ平行紡錘體、三極紡錘體以及融合紡錘體的存在，胞質(zhì)分裂異常，致使天然未減數(shù)2n花粉（圖2-26）以及連體花粉（圖2-27）的產(chǎn)生。18個胡楊雄株的平均花粉粒直徑、2n花粉以及連體花粉頻率的調(diào)查結(jié)果見表2。

一般認(rèn)為，花粉粒直徑大于該無性系或樹種花粉粒平均直徑1.28倍的花粉粒為未減數(shù)的2n花粉。在胡楊花粉中有未減數(shù)2n花粉的存在（圖2-26），且在不同基因型之間2n花粉頻率存在明顯差異（表2）。在18個胡楊雄株中，基因型HY1等16個胡楊單株可以產(chǎn)生2n花粉，基因型HY17以及HY31不產(chǎn)生2n花粉。在產(chǎn)生2n花粉胡楊雄性單株個體中，不同單株間2n花粉頻率具有一定的差異，其中以基因型HY25的2n花粉頻率最高，達(dá)4.37%；基因型HY7以及HY28的2n花粉頻率最低，僅為0.49%。通過統(tǒng)計四分體時期四分體、三分體以及二分體的產(chǎn)生頻率，可以計算出理論2n花粉頻率（表2）。經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)2n花粉的理論值與實際觀察值相符。

胡楊花粉中有時也可以看見連體花粉的存在（圖2-27），也就是2個花粉粒在相接觸部位只形成不完整的花粉壁，或雖形成花粉壁但仍由胼胝質(zhì)粘連在一起的異?；ǚ?。從表2可以看出，盡管連體花粉的發(fā)生頻率較低，介于0.07%～0.55%之間，但連體花粉在胡楊不同單株間是普遍存在的。

從表2還可以看出，胡楊花粉的平均直徑為（29.7±1.9）μm。不同胡楊基因型間花粉粒平均直徑存在一定的差異，其中以基因型HY14的平均花粉粒直徑最大，為（33.0±3.5）μm，基因型 HY28的平均花粉粒直徑最小，僅為（26.5±2.9）μm。不同基因型間花粉粒直徑的方差分析結(jié)果表明，基因型對胡楊花粉粒大小的影響達(dá)到了顯著水平。基因型HY14、HY20、HY34、HY23、HY33以及 HY8的花粉粒平均直徑顯著大于基因型HY28、HY24以及HY25的平均直徑。在同一基因型內(nèi)，胡楊花粉粒直徑也存在一定的差異，其中以基因型HY25花粉粒直徑的差異最大，其標(biāo)準(zhǔn)差達(dá)5.1μm，基因型HY17花粉粒直徑的差異最小，其標(biāo)準(zhǔn)差為2.2μm。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，在溫室10～20℃切枝水培316h，胡楊小孢子母細(xì)胞可完成減數(shù)分裂。隨著減數(shù)分裂的發(fā)生、發(fā)展，雄花芽的外部形態(tài)和花藥顏色也會發(fā)生相應(yīng)變化。其中以花藥顏色變化較為明顯，由細(xì)線期的嫩綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樗姆煮w時期的淺紅色，可作為即時判別胡楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的外部形態(tài)學(xué)依據(jù)［10］。

圖1 胡楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂與花粉變異Fig.1 On meiosis of microspore mother cell and variations of pollen grains in P.euphratica

圖2 胡楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂與花粉變異Fig.2 On meiosis of microspore mother cell and variations of pollen grains in P.euphratica

表2 胡楊小胞子母細(xì)胞減數(shù)分裂四分體時期的小孢子群以及花粉變異Table 2 Frequency of different sporads，expected and observed rates of 2npollen grains，and diameter of pollen grains in P.euphratica

從減數(shù)分裂過程中染色體行為變化來看，其減數(shù)分裂雙線期和中期Ⅰ均有單價體存在，說明胡楊減數(shù)分裂偶線期聯(lián)會的二價體結(jié)合松散；另外，后期Ⅰ、末期Ⅰ以及后期Ⅱ可觀察到落后染色體，表明胡楊的19對同源染色體之間表現(xiàn)出了一定程度的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性可能與胡楊花粉的部分?jǐn)∮F(xiàn)象（圖2-28）有關(guān)。

胡楊小胞子發(fā)生過程中常常伴隨有核仁形態(tài)和核仁數(shù)目的動態(tài)變化，在減數(shù)分裂末期Ⅰ以及末期Ⅱ的子核內(nèi)，最多可見8個核仁。曾在‘中東楊’（Populus berolinensis）［11］、毛白楊（Populus tomentosa）［8，12］、響葉楊（Populus adenopoda）［10，13］、歐洲黑楊 （Populus nigra）［14］以 及 ‘通 遼 楊’（Populus mionii×Populus nigra ‘Tong liao’）［15］的小胞子母細(xì)胞減數(shù)分裂過程也發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象，這表明多核仁現(xiàn)象可能是普遍存在于楊屬植物減數(shù)分裂過程中。因核仁數(shù)目與植物的倍性關(guān)系密切，多核仁現(xiàn)象是多倍性的一種重要標(biāo)志，據(jù)此推測，這種多核仁現(xiàn)象可能與楊屬植物的古多倍體起源緊密相關(guān)［8，16］。另外，由于最多的核仁數(shù)目應(yīng)與核仁組織者（NOR）區(qū)的數(shù)目相等［17］，試驗中觀察到胡楊減數(shù)分裂末期Ⅱ的4個子細(xì)胞中核仁數(shù)目最多為8個，這與毛白楊［8］、響葉楊［10］以及通遼楊［15］的研究結(jié)果相似，據(jù)此推斷胡楊染色體組中至少有8對具有核仁組織者區(qū)的染色體。

在楊屬植物中，已在毛白楊［18-19］、響葉楊［13］、‘通遼楊’［15］、香脂楊（Populus balsamifera）［20］以及灰楊（Populus canescens）［21］等樹種中均發(fā)現(xiàn)有天然未減數(shù)2n花粉的存在。有關(guān)研究表明，染色體聯(lián)會、著絲粒分裂、中期Ⅱ紡錘體定位、胞質(zhì)分裂等異常以及減數(shù)后加倍均可導(dǎo)致2n花粉發(fā)生［22-24］。其中紡錘體定位異常倍受植物遺傳學(xué)家的關(guān)注［25］。一般認(rèn)為，平行紡錘體和融合紡錘體可致使二分體的產(chǎn)生，三極紡錘體則可導(dǎo)致三分體的產(chǎn)生。據(jù)文獻(xiàn)報道，毛白楊天然2n花粉發(fā)生主要是由于減數(shù)第二次分裂過程平行紡錘體極點(diǎn)融合所致［26］。在本研究中，減數(shù)分裂中期Ⅱ可以觀察到一定比例的平行紡錘體、三極紡錘體以及融合紡錘體的同時，也可以觀察到0～4.37%比例不等的天然2n花粉。這預(yù)示著胡楊小胞子母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅱ紡錘體定位異?？赡芘c天然2n花粉的形成相關(guān)。

連體花粉是植物小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后胞質(zhì)分裂失敗的產(chǎn)物。據(jù)文獻(xiàn)記載，松香草（Silphium perfoliatum）、毛白楊、‘通遼楊’、白楊異源三倍體等樹種中均存在一定比例的連體花粉［19，27-29］，說明連體花粉的發(fā)生在植物界具有普遍性。有關(guān)連體花粉發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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