郭郁頻，任永霞＊，劉貴河，曹春梅，閆利軍

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口075000；2.四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都611743）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界上栽培面積最廣的一種優(yōu)良豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱。同時，苜蓿又是改良土壤、防止水土流失、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的草種之一。我國北方苜蓿種植面積已達(dá)280萬hm2［1］，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、生態(tài)環(huán)境建設(shè)、養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用。目前，北方苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，水資源匱乏日益嚴(yán)重，干旱脅迫成為了北方旱區(qū)成功建植苜蓿的主要限制因素之一。而幼苗期又是植物生長發(fā)育過程中的一個非常重要時期，幼苗期抗旱性能的強(qiáng)弱將直接影響到植物是否能順利完成整個生育期，故在實際生產(chǎn)中常說“保苗是關(guān)鍵”。

鈣（Ca2＋）被稱為“植物代謝和發(fā)育的主要調(diào)控者”［2］，它不僅是植物所需要的大量營養(yǎng)元素，而且是偶聯(lián)胞外刺激和胞內(nèi)反應(yīng)的第二信使［3］。尤其在環(huán)境脅迫下，鈣還與細(xì)胞內(nèi)Ca2＋受體－鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合起作用，參與脅迫信號的感受、傳遞、響應(yīng)和表達(dá)，能減輕環(huán)境脅迫對植物細(xì)胞膜的傷害，從而提高植物的抗逆性。赤霉素（GA3）是一類重要的植物生長調(diào)節(jié)激素，能促進(jìn)多種作物種子萌發(fā)與幼芽生長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛的應(yīng)用［4］。已有研究表明，外源鈣Ca2＋、GA3及Ca－GA的施用能減緩干旱脅迫的傷害，提高植物的抗旱性，已在小麥（Triticumaestivum）、水稻（Oryzasativa）、棉花（Gossypiumhirsutum）、谷子（Setariaitalica）、大豆（Glycine max）、番茄（Lycopersiconesculentum）等農(nóng)作物［5－10］及藥用、花卉、油料等植物應(yīng)用上取得了很好的效果［11－13］。目前，干旱脅迫下鈣對苜?？购敌缘木徑庑?yīng)報道較少［3］，更鮮見GA3以及Ca2＋＋GA3復(fù)合緩解干旱脅迫對苜蓿的影響報道。

因此，本試驗針對我國北方旱區(qū)苜蓿建植過程中存在缺苗、幼苗生長不良等問題，以苜蓿幼苗為試驗材料，采用營養(yǎng)缽沙培1／2Hoagland營養(yǎng)液法，研究PEG－6000脅迫下外源CaCl2、GA3及CaCl2＋GA3復(fù)合液處理對苜蓿苗期生理特性的影響，并應(yīng)用隸屬函數(shù)法探究最佳的處理濃度和復(fù)合液比例，為合理使用外源物質(zhì)減輕苜蓿苗期干旱脅迫危害提供理論依據(jù)，并為北方旱區(qū)苜蓿的成功建植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的苜蓿品種為中苜一號紫花苜蓿，種子來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所。采用1／2Hoagland營養(yǎng)液（不含Ca2＋）［14］沙培苜蓿幼苗，于2013年3－7月在河北北方學(xué)院溫室大棚與植物生理實驗室內(nèi)進(jìn)行。播種前細(xì)沙反復(fù)沖洗并在90℃高溫下滅菌5h，每個營養(yǎng)缽（規(guī)格：口徑為14cm，高為11cm，底部不透水）放細(xì)沙100g，苜蓿種子用0.1%HgCl2浸泡10min，蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。每個營養(yǎng)缽均勻撒播15粒種子，再覆蓋1 cm厚的細(xì)沙，用手輕輕壓實，第一次每個營養(yǎng)缽澆灌1／2Hoagland營養(yǎng)液50mL。以后每天于18：00補(bǔ)充1／2 Hoagland營養(yǎng)液，以使幼苗正常生長。出苗后每個營養(yǎng)缽間苗留苗10株，共180個營養(yǎng)缽。

1.2 試驗設(shè)計

待幼苗長至三葉期時，以不同處理溶液分別澆灌幼苗。

1.2.1 CaCl2處理 CK1（對照1）：1／2Hoagland營養(yǎng)液（不進(jìn)行干旱脅迫）；CK2（對照2）：20%PEG＋1／2 Hoagland營養(yǎng)液（干旱脅迫）；Ca5：5mmol／L CaCl2＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液；Ca10：10mmol／L CaCl2＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液；Ca20：20mmol／L CaCl2＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液。

1.2.2 GA3處理 CK1：同上；CK2：同上；GA50：50mg／L GA3＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液；GA100：100mg／L GA3＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液；GA150：150mg／L GA3＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液。

1.2.3 CaCl2＋GA3復(fù)合液處理 用1.2.2、1.2.3 各自篩選出的最佳處理（10mmol／L CaCl2，100mg／L GA3）設(shè)計CaCl2與 GA3體積比1∶1，1∶2，2∶1和質(zhì)量比1∶1四種復(fù)合液（以T1∶1，T1∶2，T2∶1和Z1∶1表示）。

10mmol／L CaCl2＋20%PEG＋1／2Hoagland與100mg／L GA3＋20%PEG＋1／2Hoagland兩者分別以體積比1∶1，1∶2和2∶1混合，混合液即分別為 T1∶1、T1∶2、T2∶1，Z1∶1（質(zhì)量比）為10mmol／L CaCl2＋100 mg／L GA3＋20%PEG＋1／2Hoagland營養(yǎng)液。CK1、CK2同上，以Ca10、GA100為另外兩個對照。

以上每處理各15個營養(yǎng)缽。每個營養(yǎng)缽澆灌50mL處理液，分兩次完成。幼苗處理3d后，先在9：00－11：30進(jìn)行葉綠素相對含量的測定，再剪取葉片進(jìn)行葉片質(zhì)膜透性的測定及酶液的制備，酶液及其余葉片0～4℃冷藏，1～2d內(nèi)用于其他生理生化指標(biāo)測定。

1.3 生理生化指標(biāo)的測定及方法

葉綠素相對含量（SPAD值）使用SPAD－502型葉綠素含量測定儀測定。葉片質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)率法［15］，用相對電導(dǎo)率表示。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［15］。脯氨酸（proline，Pro）含量采用酸性茚三酮法［15］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測定采用南京建成生物公司的試劑盒進(jìn)行。過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法［15］。以上指標(biāo)除相對葉綠素含量6次重復(fù)（每重復(fù)在幼苗頂端小葉葉片上測定3個固定部位，測10個葉片）外，其他指標(biāo)均各3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，差異顯著時用LSD法進(jìn)行多重比較。百分率數(shù)據(jù)方差分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

利用隸屬函數(shù)法［16］對CaCl2、GA3及CaCl2＋GA3復(fù)合液處理對干旱脅迫下苜蓿幼苗緩減的生理效應(yīng)進(jìn)行綜合評價。每個樣品各項指標(biāo)的具體隸屬函數(shù)值計算公式為：

式中，X為參試樣品某一抗旱指標(biāo)的測定值，Xmax、Xmin分別為所有試樣中該指標(biāo)的最大值和最小值，若所測指標(biāo)與植物的抗旱性呈正相關(guān)，則采用（1）式計算隸屬值，負(fù)相關(guān)則用（2）式。最后把每個試樣各項指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加，取其平均值。平均值越大，抗旱性越強(qiáng)，反之，抗旱性越弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗葉綠素相對含量的影響

為了探討CaCl2、GA3及復(fù)合液對葉綠素相對含量的影響，進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明，各處理間葉綠素相對含量的差異達(dá)到顯著水平（F值為2.416，P＝0.015＜0.05）。由表1可知，干旱脅迫下CK2的葉綠素相對含量比正常幼苗 CK1的低；Ca5、Ca10、GA50、T1∶1、T1∶2、T2∶1處理葉綠素相對含量都高于 CK2，且 Ca10、T2∶1處理與CK2差異顯著，Ca10、T2∶1間差異不顯著；Ca10、GA50間差異顯著，GA50、T2∶1間差異不顯著?？梢?，經(jīng)適宜的CaCl2、GA3及復(fù)合液處理能提高干旱脅迫下苜蓿幼苗葉片葉綠素相對含量。

2.2 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗相對電導(dǎo)率的影響

從表1中相對電導(dǎo)率數(shù)據(jù)可以看出，干旱脅迫下CK2幼苗葉片的相對電導(dǎo)率顯著高于正常幼苗CK1，是正常幼苗CK1的1.3倍，說明質(zhì)膜受到傷害，幼苗受到了傷害。經(jīng)CaCl2、GA3及復(fù)合液處理的相對電導(dǎo)率均低于或顯著低于CK2，并且Ca10與CK2差異顯著，Ca10與CK1間差異不顯著；GA50與CK1差異顯著，GA100、GA150與CK1差異不顯著；4個復(fù)合液處理的相對電導(dǎo)率與CK1均無顯著性差異，說明復(fù)合液處理都有保護(hù)細(xì)胞膜的作用。因此，就相對電導(dǎo)率而言，CaCl2以10mmol／L為好，GA3以50和100mg／L較好，復(fù)合液以 T1∶1、T2∶1為好。

2.3 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗MDA含量的影響

不同處理MDA含量變化見表1。干旱脅迫下CK2幼苗葉片MDA含量比CK1顯著升高，是CK1的1.7倍。經(jīng)CaCl2、GA3及復(fù)合液處理后，除GA150和Z1∶1外，其他各處理MDA含量均降低，說明適宜的外源物質(zhì)能減少膜脂過氧化產(chǎn)物 MDA的生成。其中，Ca5、Ca10、GA50、T1∶1、T1∶2處理與CK1差異不顯著，與CK2差異顯著，且T1∶1處理MDA含量最低。因此，就MDA含量而言，干旱脅迫下，CaCl2以5～10mmol／L、GA3以50mg／L、復(fù)合液以T1∶1處理效果較好。

表1 CaCl2和GA3及復(fù)合液處理對干旱脅迫下苜蓿幼苗生理生化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of CaCl2，GA3and complex liquid on physiological and biochemical indicators of the seedlings of alfalfa under drought stress

2.4 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗脯氨酸含量的影響

由表1可知，干旱脅迫下CK2幼苗葉片脯氨酸含量顯著上升，為CK1的5.9倍，其他各處理脯氨酸含量也均高于CK1，Ca5、Ca10、Ca20脯氨酸含量分別為CK1的1.9，2.6和8.6倍；GA50、GA100、GA150分別為 CK1的2.7，3.3和6.6倍；復(fù)合液T1∶1、T1∶2、T2∶1與Z1∶1分別為CK1的2.4，2.3，3.1和3.6倍。方差分析結(jié)果表明，脯氨酸含量在各處理間（F值為74.718）的差異達(dá)顯著水平。與CK2相比，脯氨酸含量隨著CaCl2、GA3濃度的升高呈先下降后上升的趨勢，Ca20、GA150處理顯著高于CK2，Ca5、Ca10、GA50和GA100處理顯著低于CK2；各復(fù)合液處理脯氨酸含量均顯著低于CK2，并且T1∶1、T1∶2處理低于Ca10、GA50處理，顯著低于GA100、Z1∶1處理，T1∶1與T1∶2間差異不顯著。

2.5 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗SOD活性的影響

由表1可知，苜蓿幼苗在干旱脅迫下，其SOD活性明顯升高，CK2是CK1的1.6倍，CK2與CK1間差異顯著，提示細(xì)胞中抗氧化酶體系動態(tài)平衡被打破。當(dāng)外源施用不同濃度的CaCl2、GA3后，SOD活性呈現(xiàn)隨CaCl2、GA3濃度的升高而增加的趨勢，CaCl2、GA3分別以Ca20、GA150處理的SOD活性最高，清除活性氧能力最強(qiáng)，且Ca20、GA150間差異不顯著；復(fù)合液處理中，T1∶2的SOD活性最高，并且T1∶2處理顯著高于Ca20、GA150處理。

2.6 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗POD活性的影響

方差分析結(jié)果顯示，CaCl2、GA3及復(fù)合液處理對POD活性的影響達(dá)顯著水平（F值為7.695）。由表1可知，CK2的POD活性高于CK1，是CK1的1.4倍。CaCl2處理中，Ca10處理的POD活性最高，其次為Ca5、Ca20；GA3處理中，GA100的POD活性最高，其次為GA150、GA50；復(fù)合液處理中，T1∶1的POD活性最高，其次為T2∶1、T1∶2、Z1∶1。并且Ca10、T1∶1、T2∶1、T1∶2與CK2差異顯著，GA100與CK2差異不顯著?？梢?，不同處理可以促進(jìn)干旱脅迫下苜蓿幼苗葉片POD活性的增加，并且各以10mmol／L CaCl2、50mg／L GA3及復(fù)合液T1∶1的效果較好。

2.7 CaCl2、GA3及其復(fù)合液對干旱脅迫下苜蓿幼苗緩減的生理效應(yīng)綜合評價

采用隸屬函數(shù)法分別對干旱脅迫下不同處理對苜蓿幼苗6個生理生化指標(biāo)的影響進(jìn)行全面、綜合的評價，比較不同處理對苜蓿幼苗抗旱性影響的大小。隸屬函數(shù)分析結(jié)果表明（表2），在CaCl2處理中，Ca10即10mmol／L CaCl2效果最好，在GA3處理中，GA100即100mg／L GA3效果最好，在CaCl2＋GA3兩種外源物質(zhì)復(fù)合液處理中，T1∶1處理效果最好，且優(yōu)于單獨的Ca10、GA100處理。各個處理對苜蓿幼苗干旱下的緩解效應(yīng)從強(qiáng)到弱依次為：T1∶1＞10mmol／L CaCl2＞T2∶1＞CK1＞T1∶2＞100mg／L GA3＞Z1∶1＞CK2。

表2 CaCl2和GA3及復(fù)合液處理對干旱脅迫下苜蓿幼苗抗旱性影響的綜合評價Table 2 Comprehensive evaluation of the effect of CaCl2，GA3and complex liquid on the drought tolerance of the seedlings of alfalfa

3 討論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要物質(zhì)，反映了牧草生長的內(nèi)在動力。受到干旱脅迫時，植物氣孔發(fā)生關(guān)閉使得凈光合作用降低。當(dāng)葉綠素含量升高時，植物的光合速率就相應(yīng)地加快，植物的生長狀況就越好［17］。本研究中，干旱脅迫下葉綠素相對含量下降，而經(jīng) Ca5、Ca10、GA50、GA150及復(fù)合液 T1∶1、T1∶2、T2∶1處理后，葉綠素含量都有所提升，表明CaCl2、GA3及復(fù)合液在一定程度上能提升苜蓿幼苗的光合速率，有利于增強(qiáng)抗旱性。其中，CaCl2以10mmol／L的處理效果最好，GA3以50mg／L處理效果最好，復(fù)合液以T2∶1處理效果最好。

MDA和電導(dǎo)率是植物受傷害的兩個重要的生理指標(biāo)。MDA是植物細(xì)胞膜脂過氧化最主要的產(chǎn)物之一，其含量通常用于評價膜脂過氧化的程度；電導(dǎo)率是判定植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性的一個重要指標(biāo)［18］。MDA含量越多，電導(dǎo)率越大，說明植物受傷害的程度越嚴(yán)重［19］。本研究中，干旱脅迫下苜蓿幼苗葉片相對電導(dǎo)率、MDA含量均顯著增加，表明脅迫下細(xì)胞膜脂過氧化程度加劇，質(zhì)膜遭到破壞。外源施用10mmol／L CaCl2、100mg／L GA3及T1∶1、T2∶1復(fù)合液后，相對電導(dǎo)率下降、MDA含量顯著降低，說明外源物質(zhì)可以緩解干旱脅迫造成的苜蓿幼苗葉片的膜脂過氧化，對細(xì)胞膜具有保護(hù)和修復(fù)作用，可減輕或防止膜系統(tǒng)的過氧化傷害。這與姜義寶等［3］的研究結(jié)果一致。

正常條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于動態(tài)平衡，逆境時，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，對植物造成傷害。SOD和POD為植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶，與其他保護(hù)酶類協(xié)同清除逆境脅迫下過量的活性氧，維持活性氧的代謝平衡［20］。多數(shù)研究表明，植物在遭受逆境脅迫時，其體內(nèi)SOD、POD活性均會上升［21］。本研究也表明，在干旱脅迫下，苜蓿幼苗的SOD活性、POD活性均顯著上升，這與姜義寶等［22］的研究一致，說明抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，幼苗生長受到抑制。當(dāng)加入不同處理的外源物質(zhì)后，其活性氧清除能力表現(xiàn)出差異。外源CaCl2濃度為10 mmol／L、GA3濃度為100mg／L時，POD活性最高；外源CaCl2濃度為20mmol／L、GA3濃度為150mg／L時，SOD活性最高；復(fù)合液以T1∶2處理的SOD活性最高，以T1∶1處理的POD活性最高。研究結(jié)果表明，在上述外源物質(zhì)適宜濃度及復(fù)合液處理下，可使干旱脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)的保護(hù)酶活性得到改善和增強(qiáng)，從而清除植物在逆境中產(chǎn)生的過量活性氧，在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害，保護(hù)植株正常生長。

植物受到干旱脅迫時，植物體內(nèi)的Pro含量會積累。目前，Pro含量的增加與植物耐旱性之間的關(guān)系存在不同的看法，有研究表明Pro的積累可對質(zhì)膜起保護(hù)作用，降低電解質(zhì)外滲，從而維護(hù)細(xì)胞正常的代謝活動，也有研究認(rèn)為逆境下Pro積累是受到傷害的征兆［23］。在本試驗中，干旱脅迫下Pro含量顯著升高，低濃度CaCl2、GA3及4個復(fù)合液處理后Pro含量均降低，而高濃度CaCl2、GA3處理Pro含量積累量更高。表明干旱脅迫抑制了脯氨酸Pro的代謝，低濃度CaCl2、GA3及4個復(fù)合液處理使干旱脅迫有所緩解。這與玉米（Zeamays）、小麥的研究結(jié)果一致［24－25］。但與姜義寶等［3］的研究結(jié)果不一致。

4 結(jié)論

干旱脅迫下，苜蓿幼苗經(jīng)一定濃度的外源CaCl2、GA3及復(fù)合液處理時，外源物質(zhì)的施用可顯著降低干旱脅迫對苜蓿幼苗的傷害，減輕、緩解干旱脅迫并提高了苜蓿幼苗的抗旱性。外源CaCl2、GA3的最佳處理濃度分別為10mmol／L、100mg／L，CaCl2＋GA3復(fù)合液處理以體積比1∶1最好。隸屬函數(shù)綜合評價不同處理對苜蓿幼苗干旱下的緩解效應(yīng)從強(qiáng)到弱依次為：T1∶1＞10mmol／L CaCl2＞T2∶1＞CK1＞T1∶2＞100mg／L GA3＞Z1∶1＞CK2。

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