周淼平， 姚金保， 張 鵬， 楊學(xué)明， 余桂紅， 馬鴻翔

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

小麥紋枯病(Wheat sharp eyespot)主要由禾谷 絲核菌(Rhizoctonia cerealis vander hoeven)引起，是危害性較大的世界性小麥土傳真菌病害［1-3］，現(xiàn)已成為中國長江中下游麥區(qū)和黃淮麥區(qū)的主要病害，每年造成的產(chǎn)量損失嚴(yán)重［4］?？共∑贩N的培育和應(yīng)用是控制該病害最經(jīng)濟(jì)和有效的途徑，小麥抗性的準(zhǔn)確鑒定是培育小麥抗病品種以及紋枯病抗性遺傳分析的關(guān)鍵。目前已報道的小麥紋枯病抗性鑒定方法多樣，鑒定標(biāo)準(zhǔn)不一，主要分為自然病圃鑒定和人工接種鑒定［5］，人工接種鑒定根據(jù)接種方法的不同，又有玉米砂混法、菌絲外貼法、嵌入法、土表接種法和溝帶接種法［6-8］。這些鑒定方法采用的接種菌株不完全相同，病害調(diào)查方法也不一致，并且鑒定結(jié)果易受環(huán)境影響，因而病害鑒定結(jié)果存在差異，影響了對小麥材料抗性的準(zhǔn)確評價。另外，小麥根部和莖基部其他病害，如小麥根腐病、小麥全蝕病以及小麥莖腐病等，由于與紋枯病早期病征相似，也對抗性的準(zhǔn)確評價造成干擾［1，9］。因此，建立準(zhǔn)確和可靠的小麥紋枯病抗性鑒定方法非常必要。

為鑒別病原菌，一些基于普通PCR技術(shù)的檢測方法，如 RAPD［10］、競爭性 PCR［11］以及rDNA的 ITS 序列差異［12］等，先后應(yīng)用于禾谷絲核菌的檢測，但這些方法尚不能對禾谷絲核菌進(jìn)行定量評估。實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)很好地解決這一問題，通過在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量，與普通PCR技術(shù)相比，其特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。目前，該技術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于土壤中紋枯病病菌DNA的定量檢測［13-14］，少量感病小麥莖稈材料也嘗試采用該技術(shù)進(jìn)行禾谷絲核菌DNA含量的定量測定［9］，但小麥莖稈中禾谷絲核菌的DNA含量與小麥自身的紋枯病抗性的關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報道。

本研究的目的是建立小麥莖稈材料中禾谷絲核菌DNA含量的定量測定方法，探索小麥紋枯病抗性與其莖稈中禾谷絲核菌DNA含量的關(guān)系，為今后開展小麥紋枯病抗性鑒定和抗性QTL的定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥紋枯病抗病品種CI12633和感病品種揚(yáng)麥158以及其他44份供試品種或品系(表1和表2)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所小麥?zhǔn)冶４婧吞峁?。小麥禾谷絲核菌R0301由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳懷谷研究員提供。

1.2 DNA提取和濃度測定

小麥禾谷絲核菌DNA和小麥莖稈(含葉鞘)DNA均采用Karroten DNA提取試劑盒(北京西美杰科技有限公司生產(chǎn))提取，DNA濃度和質(zhì)量采用Eppendorf Biophotometer測定。

1.3 小麥背景的禾谷絲核菌DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1 Real-time PCR反應(yīng)體系 Real-time PCR引物序列參考文獻(xiàn)［13］，正反向引物序列分別為5'-CCTAAATGAGTCTGGAGTAAGTC-3'和5'-GCTAGTGCGGTCAATGTATAG-3'。Real-time PCR采用SYBR?GreenI試劑(TaKaRa公司生產(chǎn))在LightCycler2.0熒光定量PCR儀(Roche公司生產(chǎn))上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為10 μl，含2 ×SYBR ? Premix Ex TaqTM5 μl，5 μmol/L正反向引物各 1 μl，模板 DNA 3 μl。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將禾谷絲核菌DNA按濃度梯度分別摻入未接種的寧麥13 DNA溶液(濃度15 ng/μl)中，使禾谷絲核菌DNA最終濃度分別為40 000.0 μg/L、4 000.0 μg/L、400.0 μg/L、40.0 μg/L、4.0 μg/L、0.4 μg/L。采用禾谷絲核菌 DNA濃度梯度樣品為模板進(jìn)行Real-time PCR，以禾谷絲核菌DNA量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Real-time PCR獲得的Ct值為縱坐標(biāo)，采用Excel軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 小麥禾谷絲核菌接種及其DNA含量測定

小麥禾谷絲核菌接種分別采用田間接種和室內(nèi)幼苗接種2種方法。田間接種采用病麥粒嵌入法，于2014年3月小麥拔節(jié)期將帶有禾谷絲核菌的麥粒嵌入到小麥植株貼近地面的基部第1～2葉鞘之間，噴霧保濕3 d。室內(nèi)幼苗接種采用菌絲直接接種，小麥種子經(jīng)萌發(fā)催芽，芽長5 mm左右，浸于經(jīng)3 mm直徑鋼珠打碎的禾谷絲核菌菌絲懸浮液中5 min，每10粒接種后的種子呈直線均勻置于滅菌的濕潤紙巾(24 cm×16 cm)上，芽的生長方向指向紙巾邊緣，芽上端離紙巾邊緣3 cm，將紙巾從一端向另一端卷起，置于泡沫盒中，20℃，保濕培養(yǎng)。

首先采用抗紋枯病品種CI12633和感紋枯病品種揚(yáng)麥158探索合適的定量測定取樣時間，于田間接種后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 和14 d 各取5 株小麥植株基部莖稈(1 cm，含葉鞘)，混合，液氮磨碎，提取DNA，進(jìn)行定量檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病原菌DNA含量，重復(fù)3次。室內(nèi)接種后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d和12 d取10株小麥基部莖稈(含葉鞘)，檢測方法同上。

其他供試小麥品種樣品按同樣方法接種，于接種后12 d取樣，DNA提取和定量檢測同上，重復(fù)3次。

1.5 小麥品種的紋枯病抗性鑒定

田間接種后于小麥乳熟期調(diào)查紋枯病發(fā)病情況，每個品種調(diào)查15～20個發(fā)病莖稈，計算平均病級。病級根據(jù)王裕中等［15］方法略作修改:1級:葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖;2級:病菌侵入莖稈，病斑寬度環(huán)莖不超莖稈周長1/2;3級:莖稈上病斑環(huán)莖寬度為莖稈周長1/2～3/4;4級:莖稈上病斑繞莖稈3/4以上，或莖稈已軟腐;5級:枯孕穗或枯白穗。

接種后的室內(nèi)幼苗于取樣當(dāng)天調(diào)查紋枯病發(fā)病情況，根據(jù)病害嚴(yán)重度將病級分為5級:1級為第1葉鞘病斑長度小于1.5 cm;2級為第1葉鞘病斑長度1.5～3.0 cm;3級為第1葉鞘病斑長度大于3.0 cm，幼苗未萎焉;4級為幼苗出現(xiàn)萎蔫病癥;5級為幼苗死亡，根據(jù)調(diào)查結(jié)果，計算平均病級。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.0軟件分析不同小麥品種(系)基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量與其紋枯病抗性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥禾谷絲核菌接種方法

小麥紋枯病發(fā)病的高峰期主要在苗期和拔節(jié)孕穗期［16］，目前小麥紋枯病抗性評價方法多針對拔節(jié)孕穗期即成株期的抗性，而對小麥苗期的抗性評價方法鮮有報道。本研究在室內(nèi)采用禾谷絲核菌直接接種的方法對小麥幼苗紋枯病抗性進(jìn)行評價，該鑒定方法的溫度和濕度可控，重復(fù)性好，操作簡便。對成株期的抗性評價采用禾谷絲核菌病麥粒嵌入法在田間進(jìn)行。

本研究有10份材料同時進(jìn)行室內(nèi)苗期和田間成株期抗性鑒定，對2種抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)只有0.41，表明幼苗的紋枯病抗性機(jī)制與小麥成株期可能不完全相同。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用Guo等［13］的方法根據(jù)禾谷絲核菌β-tublin基因序列設(shè)計的引物，對小麥DNA樣品和摻有禾谷絲核菌DNA的小麥DNA背景樣品擴(kuò)增，只有摻有禾谷絲核菌DNA的小麥DNA樣品擴(kuò)增出預(yù)期的138 bp條帶，表明小麥基因組中沒有高同源性序列，可以用于小麥組織樣品中禾谷絲核菌DNA的定量檢測。優(yōu)化 LightCycler2.0熒光定量 PCR儀Real-time PCR擴(kuò)增條件，采用的擴(kuò)增條件為:95℃30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

對禾谷絲核菌DNA濃度梯度摻入的小麥DNA樣品進(jìn)行Real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)除了0.4 μg/L樣品未有擴(kuò)增產(chǎn)品外，其余樣品均能正常擴(kuò)增，且重復(fù)性較好，表明該檢測方法的最低檢測量為4 pg。以樣品中禾谷絲核菌DNA質(zhì)量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Real-time PCR測得的Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，回歸方程為Y=-3.562x+35.310，相關(guān)性較好，R2=0.999。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

2.3 小麥莖稈基部禾谷絲核菌DNA含量的定量檢測

抗病品種和感病品種接種后，基部莖稈DNA樣品作為模板進(jìn)行Real-time PCR檢測獲得相應(yīng)的Ct值，再根據(jù)圖1建立的回歸方程、DNA樣品體積以及莖稈樣品的質(zhì)量可計算出基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量。由于室內(nèi)幼苗接種菌絲的接種量大，接種2 d，抗紋枯病品種CI12633和感紋枯病品種揚(yáng)麥158基部莖稈的禾谷絲核菌DNA含量分別為267.0 ng/g和373.7 ng/g，接種6 d，抗病品種和感病品種的差異非常明顯，12 d后，抗病品種和感病品種基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量分別為1 723.9 ng/g和4 166.1 ng/g，抗病品種和感病品種基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量呈指數(shù)級增長(圖2A)。

田間接種的抗病品種和感病品種，接種2 d也可檢測出禾谷絲核菌DNA;接種8 d，基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量差別明顯，分別為179.6 ng/g和595.2 ng/g;此時小麥紋枯病病征尚未出現(xiàn)，表明該方法在小麥紋枯病的早期檢測中可以發(fā)揮重要作用;接種14 d，抗病品種和感病品種基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量分別為849.4 ng/g和3 855.1 ng/g，感病品種禾谷絲核菌DNA含量是抗病品種的4倍多;與室內(nèi)接種相似，抗病品種和感病品種基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量也呈指數(shù)級增長(圖2B)。

綜合2種接種方法結(jié)果，后續(xù)品種定量測定均采用接種后12 d的樣品。

圖2 CⅠ12633和揚(yáng)麥158接種禾谷絲核菌后，基部莖稈中禾谷絲核菌DNA含量變化Fig.2 The changes of Rhizoctonia cerealis DNA content in the stalk of CⅠ12633 and Yangmai158 after inoculation

2.4 小麥幼苗期紋枯病抗性與基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量的相關(guān)性

對42份小麥品種(系)在室內(nèi)采用禾谷絲核菌菌絲直接接種方法進(jìn)行了紋枯病抗性鑒定，結(jié)果表明，紋枯病平均病級為2.4，變幅為1.5～3.3;熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，42份材料的基部莖稈禾谷絲核菌 DNA含量平均為4 101.0 ng/g，變幅為566.3～9 887.2 ng/g(表1)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，幼苗基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量與其紋枯病平均病級具有較高的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.76(P＜0.000 1)，熒光定量PCR測定的基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量可以作為判定小麥幼苗紋枯病抗性的重要指標(biāo)(圖3)。

表1 室內(nèi)幼苗接種小麥紋枯病平均病級與莖稈禾谷絲核菌DNA含量Table 1 The average disease grade of wheat sharp eyespot and R.cerealis DNA content in the stalk by seedling inoculation

圖3 小麥幼苗期莖稈禾谷絲核菌DNA含量與紋枯病平均病級的相關(guān)性Fig.3 Correlation between R.cerealis DNA content in wheat stalk and disease grade of sharp eyespot

2.5 小麥成株期紋枯病抗性與基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量的相關(guān)性

在田間對12份小麥品種(系)采用病麥粒嵌入接種法進(jìn)行抗性鑒定，同時對基部莖稈的禾谷絲核菌DNA含量進(jìn)行定量測定(表2)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，田間小麥基部莖稈的禾谷絲核菌DNA含量與其紋枯病病級沒有明顯的相關(guān)性(r=-0.30，P=0.34)，表明對拔節(jié)期小麥基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量的定量分析結(jié)果對乳熟期小麥紋枯病抗性的判斷幫助不大。主要原因是定量分析取樣時間與紋枯病抗性調(diào)查時間相隔太長，期間小麥經(jīng)歷了孕穗期、抽穗期和開花灌漿期，并且田間可能發(fā)生禾谷絲核菌多次侵染，成株期的抗性評價與苗期抗性評價標(biāo)準(zhǔn)也不同，不僅涉及葉鞘的侵染，而且涉及莖稈的侵染。本研究接種后12 d測定的主要是葉鞘中禾谷絲核菌DNA含量，與乳熟期小麥紋枯病抗性相關(guān)不明顯也很正常。

3 討論

Real-time PCR既能進(jìn)行定性分析，又能進(jìn)行高靈敏度的定量分析，且操作簡便，近十多年來在植物病原菌的鑒別和定量分析中應(yīng)用廣泛。Guo等［13］采用該方法，不僅將禾谷絲核菌與其他20余種土壤病原菌區(qū)分開，而且可以檢測最低達(dá)100 fg的禾谷絲核菌DNA。本研究采用該方法，建立了小麥背景的禾谷絲核菌DNA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低可以檢測到4 pg的禾谷絲核菌DNA，在4 μg/L至40 000 μg/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系(R2=0.999)，對今后開展小麥莖稈的禾谷絲核菌DNA含量測定提供了很好的工具，特別對于小麥紋枯病病征尚未能明顯區(qū)分的小麥材料間的紋枯病抗性鑒別，定量PCR結(jié)果可以作為指示小麥紋枯病是否發(fā)生的重要指標(biāo)。

表2 小麥成株期紋枯病平均病級及莖稈禾谷絲核菌DNA含量Table 2 The average disease grade of wheat sharp eyespot and R.cerealis DNA content in wheat stalk by field inoculation

小麥田間紋枯病發(fā)病的高峰期主要在苗期和拔節(jié)孕穗期，目前的抗性鑒定方法多針對拔節(jié)孕穗期即成株期，對苗期的抗性和鑒定方法重視不夠。本研究采用室內(nèi)菌絲直接接種的方法進(jìn)行幼苗的紋枯病抗性鑒定，室內(nèi)鑒定溫度和濕度容易控制，抗性鑒定結(jié)果重復(fù)性好，可靠性較高。研究發(fā)現(xiàn)，小麥幼苗基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量與其紋枯病平均病級數(shù)有較高的相關(guān)性(r=0.76)，因此小麥幼苗基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量的多少可以用于預(yù)示小麥幼苗的紋枯病抗性。儀器測定可以減小人為的目測鑒定誤差，從而提高小麥幼苗抗性鑒定的準(zhǔn)確性。

小麥紋枯病與小麥白粉病類似，苗期抗性和成株期抗性不完全相同，苗期抗性只涉及葉鞘的侵染，成株期抗性不僅涉及葉鞘的侵染，對莖稈的侵染更為重要。研究也發(fā)現(xiàn)，拔節(jié)期接種12 d，小麥基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量與成株期抗性相關(guān)不明顯，本研究只調(diào)查了乳熟期小麥紋枯病的發(fā)生情況，其紋枯病平均病級與接種后12 d取樣測定的小麥幼苗基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量沒有很好的對應(yīng)關(guān)系。今后需對拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期和開花灌漿期分別進(jìn)行基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量定量測定以及紋枯病病害調(diào)查，才能正確判定小麥基部莖稈禾谷絲核菌DNA含量與其成株期抗性的關(guān)系。

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