彭中友， 孫俊銘， 李 燕， 劉慶友， 于建寧， 施振旦

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/動物品種改良與繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.貴州省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，貴州 貴陽550018;3.廣西大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

人工輔助生殖技術(shù)主要依賴卵子體外成熟(IVM)技術(shù)發(fā)展而來，IVM技術(shù)能避免超數(shù)排卵中外源激素刺激造成的副作用，如卵巢過度刺激綜合征［1-4］，但與體內(nèi)成熟卵子比較，IVM卵子發(fā)育潛力明顯不如體內(nèi)成熟卵子，IVM卵子受精率和胚胎存活率都低于體內(nèi)卵子［5］。由此國內(nèi)外對動物卵母細(xì)胞IVM條件、體外受精條件和胚胎體外培養(yǎng)條件進行了大量的研究優(yōu)化，并在牛和小鼠卵子IVM和胚胎早期發(fā)育方面取得較好進展［2，6-8］，但在豬的胚胎體外生產(chǎn)方面仍然面臨2個主要問題，一是體外多精受精率高，二是體外受精卵子發(fā)育至囊胚比例低和體外胚胎發(fā)育質(zhì)量低于體內(nèi)發(fā)育胚胎質(zhì)量［9-11］。

卵泡在發(fā)育過程中，卵子及其周圍的顆粒細(xì)胞存在相互雙向調(diào)控。卵母細(xì)胞通過旁分泌方式分泌系列生長因子如BMP、GDF9和活化素等作用于顆粒細(xì)胞促進其增殖［12］、分化［13］、代謝、凋亡［14］及卵丘擴展等［15］，其中GDF9在卵泡發(fā)生過程和早期胚胎中表達(dá)［16］，對卵巢和卵泡發(fā)育有重要調(diào)控作用［17-20］。卵泡液中GDF9含量與卵子核成熟和胚胎質(zhì)量具有顯著正相關(guān)性［21］。在卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)過程中添加GDF9能顯著提高卵子成熟和早期胚胎的發(fā)育能力，這一作用在牛［6，8］與小鼠［2，7-8］上均得到證實，Gomez等［22］將豬卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes，COCs)與 能 分 泌GDF9的裸卵(DOs)共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)DOs提高了孤雌激活后COCs中卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚的比例，但直接向豬卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)過程中添加GDF9是否能提高豬卵子成熟和早期胚胎的發(fā)育能力尚未見報道。

在卵丘細(xì)胞對卵子成熟的影響中，卵丘細(xì)胞分泌的FST特異性結(jié)合活化素(Activin，ACT)、BMP15甚至GDF9，降低這些轉(zhuǎn)化生長因子的生物活性，抑制卵母細(xì)胞的發(fā)育與成熟［7，23］。如 Silva 等［24］在牛成熟培養(yǎng)液中添加FST，劑量依賴性地抑制了胚胎發(fā)育。我們之前的研究結(jié)果表明，利用抗FST抗體處理體外培養(yǎng)的水牛卵母細(xì)胞，可以顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率及孤雌胚的發(fā)育［25］。Shi等［26］研究發(fā)現(xiàn)GDF9能夠抑制人顆粒黃體細(xì)胞FST的分泌。故推測GDF9可能是通過抑制FST的分泌而促進囊胚的發(fā)育，以及當(dāng)IVM培養(yǎng)液中同時添加GDF9與抗FST抗體時，兩種因子可能存在提高胚胎發(fā)育的加性效應(yīng)。

本研究以豬卵母細(xì)胞為模型，選用了2個單因子試驗和2個二因子有重復(fù)交叉分組的試驗設(shè)計方式，通過向豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中單獨添加GDF9，或者同時添加GDF9與FST、GDF9與抗FST抗體，以研究GDF9和FST對卵子成熟和胚胎發(fā)育的生物學(xué)作用，為最大程度提高豬的體外胚胎生產(chǎn)質(zhì)量和效率提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 豬卵母細(xì)胞的采集和IVM培養(yǎng)

從屠宰場采集新鮮豬卵巢，置于30～33℃滅菌生理鹽水中，2 h內(nèi)送達(dá)實驗室。用帶有18號針頭的10 ml注射器抽取卵巢表面直徑為2～6 mm的卵泡，將抽取液放入15 ml離心管中。讓COCs自然沉降15 min，用含2%FBS的TCM199洗滌沉降物2～3次。實體顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻且至少有3層完整顆粒細(xì)胞包圍的COCs，用成熟培養(yǎng)液洗滌3次，再用成熟培養(yǎng)液(TCM-199+10%豬卵泡液+10 UI/ml eCG+10 UI/ml hCG+0.6 mmol/L半胱氨酸)洗滌3次后進行成熟培養(yǎng)。液滴式培養(yǎng)，液滴大小為150 μl，每滴內(nèi)培養(yǎng) 40～50枚卵母細(xì)胞，培養(yǎng)條件為39℃，5%CO2的空氣，飽和濕度。培養(yǎng)22 h后換成不含激素的成熟培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h。

GDF9和抗GDF9抗體對豬卵母細(xì)胞成熟和胚胎早期發(fā)育的影響采用單因子試驗:卵子IVM過程中，對照組使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，試驗組3份培養(yǎng)液中GDF9的添加濃度分別為100 ng/ml、200 ng/ml和300 ng/ml，另3份培養(yǎng)液中抗GDF9抗體的濃度分別為 2.5 μg/ml、5.0 μg/ml和 10.0 μg/ml;GDF9(0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml)與 FST(0 μg/ml、0.1 μg/ml、1.0 μg/ml)或 抗 FST 抗 體 (0 μg/m、50 μg/ml、100 μg/ml)的共同作用采用2因子交叉分組試驗設(shè)計?？笹DF9抗體和抗FST抗體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動物品種改良與繁育重點實驗室制備保存，其制備方法見之前發(fā)表文獻［25］、［27］;GDF9和FST購自R＆D公司，其余試劑均購自Sigma公司。

1.2 卵母細(xì)胞孤雌激活和早期胚胎培養(yǎng)

將培養(yǎng)44～45 h的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體移入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化，去除卵丘細(xì)胞，挑選排出第一極體且胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。然后用電激活液清洗融合槽3～4遍，將卵母細(xì)胞在電激活液中清洗2～3遍并靜置2～3 min，然后移入覆蓋滿電激活液的融合槽中，互相間有空隙的一字排開，再以1.0 kV/cm 80 μs 3DC進行電激活。將激活處理過后的卵母細(xì)胞于培養(yǎng)液PZM3(含有5 μg/ml細(xì)胞松弛素B和10 μg/ml放線菌酮)中化學(xué)激活4 h，然后在PZM-3中清洗2～3遍，再置于38.5℃含5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱進行連續(xù)培養(yǎng)。

1.3 成熟率、卵裂率、囊胚率的統(tǒng)計

培養(yǎng)44 h后的卵母細(xì)胞成熟以排出第一極體為標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合成熟卵形態(tài)學(xué)進行評價。孤雌激活后24 h統(tǒng)計卵裂率，7 d后統(tǒng)計囊胚率。成熟率=成熟卵子數(shù)/卵子總數(shù)，卵裂率=卵裂數(shù)/總卵數(shù)，囊胚率=囊胚率/卵裂數(shù)。

1.4 囊胚染色及囊胚細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計

參照文獻［13］方法用染料Hoechst33342對囊胚進行染色。收集孤雌激活后第7 d對照組和各處理組的囊胚，在洗液中洗3次，然后置于20 μg/ml Hoechst33342的CCM液(Gibco，不含鈣鎂)中避光室溫孵育2 min，再在操作液中洗3次，將囊胚移到載玻片上甘油液滴內(nèi)，蓋上蓋玻片并輕輕擠壓使細(xì)胞平鋪，封片后在熒光顯微鏡(購自Nikon公司)下觀察，進行囊胚總細(xì)胞計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗至少重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用分析軟件SAS 9.0進行ANVOA分析。

2 結(jié)果

2.1 GDF9對豬卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率和囊胚率的影響

成熟培養(yǎng)液中添加較低濃度(100 ng/ml和200 ng/ml)GDF9對卵母細(xì)胞成熟率無顯著影響，較高濃度(300 ng/ml)GDF9則顯著抑制卵母細(xì)胞的成熟(表1);3種濃度GDF9對卵裂率則都無影響。成熟液中添加較低濃度GDF9可以提高囊胚率，將其從對照組的14.7% 顯著提高到200 ng/ml處理組的24.8%。當(dāng)GDF9添加濃度繼續(xù)提高到300 ng/ml時，囊胚率僅增加到20.2%，與對照組差異不顯著。

2.2 抗GDF9抗體對豬卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率與囊胚率的影響

如表2所示，成熟培養(yǎng)液中添加抗GDF9抗體可以抑制卵母細(xì)胞的成熟率和孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率，且抑制作用具有劑量依賴性。

表1 不同濃度GDF9對體外卵子發(fā)育能力的影響Table 1 The effects of different concentrations of GDF9 on in vitro oocyte developmental competence

表2 不同濃度抗GDF9抗體對體外卵子發(fā)育能力的影響Table 2 The effects of different concentrations of anti-GDF9 antibody on in vitro oocyte developmental competence

2.3 共同添加GDF9和FST對卵子發(fā)育能力的影響

成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度FST對卵子成熟率和孤雌胚卵裂率無顯著影響，但隨著FST劑量的增加囊胚率極顯著降低，同時囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著降低。當(dāng)向0 μg/ml FST的培養(yǎng)液中分別添加濃度為0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9，囊胚率依次分別為42.8%、42.9%、51.2%，囊胚總細(xì)胞數(shù)分別為52、47和44;當(dāng)向0.1 μg/ml FST 的培養(yǎng)液中分別添加濃度為 0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9，囊胚率依次分別為 32.4%、45.5%和35.9%，囊胚總細(xì)胞數(shù)分別為49、50和50;當(dāng)向1.0 μg/ml FST 中分別添加 0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9時，囊胚率分別為24.3%、35.8%和41.2%，囊胚的細(xì)胞數(shù)依次分別為43、43和46(表3)。由此可見，F(xiàn)ST降低了GDF9對胚胎發(fā)育的促進作用。

表3 共同添加GDF9和FST對卵子成熟和早期胚胎發(fā)育的影響Table 3 The effects of adding GDF9 and FST together in muration medium on oocyte maturation and early embryo development

2.4 共同添加GDF9和抗FST抗體對卵子發(fā)育能力的影響

成熟培養(yǎng)液中單獨添加抗FST抗體時，增加了囊胚率，呈劑量依賴性，當(dāng)添加抗FST抗體濃度為100 μg/ml時，囊胚率為 59.9%，與對照組(42.5%)相比差異顯著。當(dāng)向含有抗FST抗體濃度為 50 μg/ml的培養(yǎng)液中分別添加濃度為 0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的 GDF9，囊胚率分別為 53.3%、66.5%和58.2%;當(dāng)向抗FST抗體濃度為 100 μg/ml的培養(yǎng)液中分別添加濃度為 0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的 GDF9，囊胚率分別為 59.9%、55.6%、52.8%;與對照組囊胚率(42.5%)相比，培養(yǎng)液中同時添加50 μg/ml抗FST抗體和100 ng/ml GDF9時囊胚率提高到66.5%(表4)，表明共同添加抗FST抗體和GDF9對胚胎發(fā)育的促進作用具有明顯的加性效應(yīng)，且抗FST抗體和GDF9最適添加濃度分別為50 μg/ml和100 ng/ml。從表4可以看出，各處理組的成熟率、卵裂率和囊胚總細(xì)胞數(shù)與對照組相比均無顯著差異。

表4 共同添加GDF9和抗FST抗體對卵子成熟和早期胚胎發(fā)育的影響Table 4 The effects of adding GDF9 and anti-FST antibody together in maturation medium on oocyte maturation and early embryo development

3 討論

本研究通過向IVM培養(yǎng)過程中添加GDF9或者抗GDF9抗體，從正反兩方面證明了IVM培養(yǎng)液中添加GDF9具有促進豬早期胚胎發(fā)育的生物學(xué)作用。通過向培養(yǎng)液中同時添加GDF9和FST或者抗FST抗體進一步研究表明，F(xiàn)ST降低了GDF9對胚胎發(fā)育的促進作用;同時添加GDF9和抗FST抗體對胚胎發(fā)育的促進作用具有加性效應(yīng)。

豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度GDF9提高了囊胚率，當(dāng)培養(yǎng)液中添加GDF9濃度為200 ng/ml時囊胚率顯著提高，表明豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中GDF9添加的最適濃度為200 ng/ml，但另一方面，GDF9對卵裂率和囊胚細(xì)胞數(shù)沒有顯著影響。Gomez等［22］將豬COCs與能分泌 GDF9的裸卵(DOs)共同培養(yǎng)也發(fā)現(xiàn)DOs提高了孤雌激活后COCs中卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚的比例，但對卵裂率和囊胚總細(xì)胞數(shù)同樣沒有顯著影響。相同的工作在牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)中也得到了證實［6］。在小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加GDF9也同樣促進了囊胚的發(fā)育［2］。這些研究結(jié)果都與我們的研究結(jié)果一致。我們試驗還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加抗GDF9抗體時顯著降低了囊胚率，而且具有劑量依賴性。Hussein等［7］發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加smad2/3特異抑制劑SB-431542阻斷GDF9的下游通路后，顯著降低了囊胚發(fā)育能力。研究結(jié)果表明，GDF9缺陷型小鼠可以形成原始和初級卵泡，但之后卵泡發(fā)育受阻，導(dǎo)致完全不育［18，27-28］。這表明卵子分泌的內(nèi)源 GDF9對卵子進一步發(fā)育至成熟發(fā)揮著重要的作用，中和內(nèi)源GDF9或基因沉默內(nèi)源的GDF9表達(dá)都會影響卵子發(fā)育及最終成熟。

另外，添加 GDF9濃度為 100 ng/ml或 200 ng/ml時對豬卵子成熟率沒有影響，而添加高濃度(300 ng/ml)的GDF9能顯著降低成熟率。Clelland等［29］發(fā)現(xiàn)同樣屬于OSFs的BMP15具有抑制斑馬魚卵子成熟的生物學(xué)作用。若長期或重度免疫GDF9，會使具有正常生殖機能的母羊卵泡發(fā)育停留在初級階段，而不能發(fā)育至次級卵泡階段以上而導(dǎo)致羊不育;若僅是輕度免疫GDF9，則可以提高母羊的排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)［30］。因此推測過高或過低濃度的GDF9都會抑制卵泡發(fā)育。Elvin等［31］研究發(fā)現(xiàn)GDF9能夠抑制LH受體的表達(dá)，推測可能是高濃度GDF9抑制卵子成熟的原因之一。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)，向IVM培養(yǎng)液中同時添加GDF9和FST或者抗FST抗體時，同時添加GDF9和FST的囊胚率和囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著低于同時添加GDF9和抗FST抗體。當(dāng)向培養(yǎng)液中同時添加GDF9與FST時發(fā)現(xiàn)，同時添加各組囊胚率均與對照相比無顯著差異，這表明培養(yǎng)液中GDF9減弱了FST對卵子成熟和胚胎發(fā)育的抑制作用。當(dāng)向培養(yǎng)液中同時添加GDF9和抗FST抗體時囊胚率最高達(dá)到66.5%，高出對照組(42.5%)和單獨添加GDF9組(42.9%、51.2%)或單獨添加抗 FST抗體組(53.3%、59.9%)，這表明 IVM培養(yǎng)中同時添加GDF9與抗FST抗體對卵子成熟和胚胎發(fā)育的促進作用具有加性效應(yīng)。IVM培養(yǎng)中卵子周圍的卵丘細(xì)胞能合成和分泌一些調(diào)節(jié)因子，例如抑制素(INH)、活化素(ACT)和 FST［21］，在整個 IVM 過程中，這些分泌因子在培養(yǎng)液中不斷積累并通過細(xì)胞微管影響卵丘細(xì)胞的功能和卵子成熟以及后續(xù)胚胎的發(fā)育。IVM培養(yǎng)液中COCs分泌的ACT、FST和INH的濃度能夠達(dá)到 100 ng/ml以上［24，32］。培養(yǎng)液中的 ACT能促進卵子成熟和胚胎的發(fā)育，而FST和INH亞基卻阻礙卵子成熟和胚胎的發(fā)育［24，33-38］。FST通過結(jié)合ACT阻礙其與受體I和II結(jié)合，從而降低ACT的生物學(xué)活性［39-40］。同時，F(xiàn)ST與ACT的親和性比對INH的親和性高出50～100倍［39］。研究結(jié)果表明，ACT與FST的比例決定著卵子的成熟質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力［24］。因此免疫FST能增加ACT含量，進而放大ACT下游信號［41-42］，從而促進卵子成熟和胚胎發(fā)育［25］。此外，F(xiàn)ST也能特異結(jié)合 BMP15，成熟培養(yǎng)液中同時添加FST和BMP15發(fā)現(xiàn)FST降低了BMP15對卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的促進作用［7］。這些結(jié)果表明 FST可能通過結(jié)合 ACT和BMP15抑制卵子成熟和隨后胚胎的發(fā)育。Shi等發(fā)現(xiàn)GDF9抑制人顆粒黃體細(xì)胞中FST的表達(dá)［26］。GDF9和抗FST抗體促進卵子成熟和胚胎發(fā)育的加性效應(yīng)可能是因為GDF9抑制了CCs中FST的表達(dá)和抗FST抗體有效中和了培養(yǎng)液中的FST。

總之，研究結(jié)果證明了GDF9和FST分別對豬卵子IVM成熟及早期胚胎發(fā)育具有促進和抑制作用，培養(yǎng)液中共同添加GDF9和抗FST抗體對卵子成熟和胚胎發(fā)育的促進作用具有加性效應(yīng)，這將有助于提高家畜體外胚胎的產(chǎn)量和質(zhì)量。

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