劉金亮，王慶文，馮漢青，梁 燁，賈凌云

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

與動(dòng)物線粒體相比，植物線粒體存在兩條電子傳遞途徑:細(xì)胞色素途徑(CP)和交替途徑(AP)，其中交替途徑也稱抗氰呼吸途徑，該途徑是一條以交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)為末端氧化酶，把電子從泛醌庫傳遞給O2而生成水的非磷酸化電子傳遞途徑［1］。已有研究表明，交替呼吸路徑在植物抵抗病原菌侵染、低溫、干旱及氧化壓力等多種脅迫因素中扮演著重要的角色［2-3］。然而，目前在上述脅迫下對(duì)交替氧化酶生理學(xué)功能的研究主要集中在光合組織中，而事實(shí)上，脅迫對(duì)植物的根部也有影響。由于植物的根不僅對(duì)植物起支持和固著的作用，更是植物吸收水分和礦物營養(yǎng)的主要器官［4］。因此植物整體對(duì)脅迫的耐受程度在很大程度上是由植物的根部在脅迫下的生理狀態(tài)決定著。而目前植物根部對(duì)于脅迫耐受性是否與交替氧化酶有關(guān)則報(bào)道較少，這在一定程度上制約了人們?cè)诿{迫條件下對(duì)交替氧化酶的生理學(xué)功能更加全面的認(rèn)知?；诖?，本文我們利用野生型和交替氧化酶基因(AOX1a)缺失的擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料，研究并比較了鹽脅迫(NaCl)和氧化壓力(H2O2)對(duì)這兩種擬南芥植物根生長的影響。

1 材料與方法

1.1 擬南芥的種植

本實(shí)驗(yàn)所用材料為野生型(WT)擬南芥(Arabidopsis thaliana)和編碼交替氧化酶AOX1a反義抑制擬南芥突變體(AS-12)［5］。實(shí)驗(yàn)材料由Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State U-niversity(Columbus，OH，USA)提供，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并鑒定。將野生型和突變型擬南芥種子利用1%的NaClO溶液浸泡10min進(jìn)行消毒處理，離心后棄掉NaClO，用無菌蒸餾水洗滌種子5-6遍，時(shí)間間隔為1min。將處理后的種子分別點(diǎn)到已滅菌的MS固體培養(yǎng)基(含0.8%瓊脂和2.4%蔗糖)的表面，用封口膜密封后在4℃下春化4d，然后轉(zhuǎn)移到光周期為16h光照/8h黑暗、溫度為20℃的生長條件下，豎直放置培養(yǎng)皿，使植株幼根能夠垂直向下生長，在此條件下培養(yǎng)生長7d。

1.2 擬南芥的脅迫處理

鹽脅迫處理:將生長7d后的植株轉(zhuǎn)出原來的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到含有不同 NaCl濃度(0，50，100，150 mM)的MS固體培養(yǎng)基表面，在上述生長條件下繼續(xù)垂直生長8d;過氧化氫處理:將生長7d后的植株從原來的培養(yǎng)基取出，將根部分別置于不同濃度的 H2O2溶液中(0，50，100，200 mM)，于黑暗中放置8 h，溫度為20℃。

1.3 根生長速率的測(cè)量和計(jì)算

每個(gè)處理?xiàng)l件下隨機(jī)選取若干株幼苗(不少于8株)，在處理前測(cè)量植株幼苗根長度，在處理后再次測(cè)量根長度(精確到0.1mm)。植株主根生長速率R=(處理后根長度-處理前根長度)/處理時(shí)間。使用Origin 6.1軟件對(duì)不同條件處理下根的相對(duì)生長速率進(jìn)行t檢測(cè)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。

1.4 根尖細(xì)胞死亡程度觀察和測(cè)量

根據(jù)組織細(xì)胞的死亡程度采用伊文思藍(lán)染色法［6］測(cè)定，利用伊文思藍(lán)染色顏色的深淺來判斷細(xì)胞死亡程度的大小，當(dāng)染色顏色越深，表明細(xì)胞死亡程度越嚴(yán)重。室溫下，將處理后的擬南芥植株的根部浸沒在0.25%伊文思藍(lán)水溶液中，染色20 min，之后用蒸餾水漂洗兩次(每次10 min)以去除未結(jié)合的伊文思藍(lán)染液，放置過夜后，使用Olypus顯微采集系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。

1.5 交替呼吸途徑的測(cè)量

稱量植物組織后，用刀片將其切成小段，放置到緩沖液(20 mM Hepes，0.2 mM CaCl2，pH 7.2)中浸泡10 min。之后將其轉(zhuǎn)移到密閉的測(cè)量杯中，利用Clark氧電極(SP-2型，中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所制)檢測(cè)緩沖液中氧氣含量變化，依照Bingham和Farrar［7］的方法檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，采用Origin 6.0進(jìn)行顯著性差異分析(P＜0.05)并作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 兩種擬南芥植株交替呼吸途徑的鑒定

利用Clark氧電極法［7］測(cè)量和比較實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的AOX基因反義抑制突變體(AS-12)和野生型(WT，Col-0)擬南芥植株的交替途徑容量(Valt)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AS-12植株交替途徑的容量顯著低于野生型 (圖1)。

2．2 脅迫前兩種擬南芥幼根生長和細(xì)胞活力比較

WT和AS-12兩種擬南芥在MS培養(yǎng)基中生長7d后，WT和AS-12擬南芥的根長之間沒有顯著性差異(圖2A)，將以上兩種擬南芥的根用伊文思藍(lán)染色后也沒有觀察到明顯的區(qū)別(圖2B)。表明在正常生長下，交替氧化酶基因的反義抑制不會(huì)對(duì)擬南芥幼根的生長和細(xì)胞活力造成影響。

圖1 不同基因型擬南芥交替途徑容量(Valt)進(jìn)行測(cè)量和比較對(duì)比觀察Fig.1 The measurement and comparison of the alternative pathway capacity of AS-12 and WT Arabidopsis plants

圖2 脅迫處理前WT和AS-12兩種擬南芥幼根生長和細(xì)胞活力對(duì)比觀察Fig.2 The length(A)and cell viability(B)of seedling roots of wild-type(WT)and AOX1a anti-sense(AS-12)lines of Arabidopsis before salt stress and H2O2treatment

2.3 鹽脅迫對(duì)兩種擬南芥幼根生長和細(xì)胞活力的影響

將WT和AS-12兩種擬南芥幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有 0，50，100，150 mM NaCl的 MS 培養(yǎng)基中生長8d后進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，在不含NaCl的MS培養(yǎng)基中，WT與AS-12擬南芥根的生長速率沒有顯著性差別(圖3)，也說明了在正常生長下，交替氧化酶基因的反義抑制不會(huì)對(duì)擬南芥幼根的生長造成影響。隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的上升，擬南芥幼根的生長呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在50 mM NaCl濃度條件下，AS-12擬南芥幼根的生長速率低于WT型擬南芥，但差異并不顯著;在100 mM NaCl濃度條件下，AS-12擬南芥幼根的生長速率已顯著低于WT型擬南芥。在150 mM NaCl濃度下，AS-12與WT擬南芥幼根幾乎停止生長，在這個(gè)NaCl濃度下，AS-12與WT根的生長速率沒有顯著性差異(圖3)。

圖3 不同NaCl濃度下WT和AS-12擬南芥根生長速率比較Fig.3 The comparison of the rate of root growth between wild-type(WT Col-0)and AOX anti-sense(AS-12)Arabidopsis seedlings under NaCl stresses

在0 mM NaCl濃度條件下，WT和AS-12擬南芥幼根均沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象(圖4)。在50 mM NaCl濃度下，在WT根中仍然沒有觀察到細(xì)胞死亡現(xiàn)象。但是，AS-12已經(jīng)出現(xiàn)輕微的細(xì)胞死亡現(xiàn)象(圖4);而在100 mM NaCl濃度下，WT與AS-12根中均出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，但AS-12擬南芥根染色較之WT擬南芥更深。在含有150 mM NaCl的培養(yǎng)基中，AS-12和WT擬南芥均著色較深，且沒有明顯的區(qū)別(圖4)。

2.4 過氧化氫對(duì)兩種擬南芥幼根生長和細(xì)胞活力的影響

將WT和AS-12兩種擬南芥的幼根分別置于不同濃度的H2O2溶液中，發(fā)現(xiàn)在0 mM H2O2濃度條件下，兩種擬南芥根的生長速率沒有出現(xiàn)明顯差別，隨著外源H2O2濃度的增加，兩種擬南芥根的生長速率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在50 mM H2O2濃度條件下，AS-12擬南芥根的生長速率低于WT，但尚無顯著性差異。在100和200 mM H2O2濃度條件下，AS-12與WT的生長速率均進(jìn)一步降低，但兩者之間基本處于同一水平(圖5)。

圖4 不同NaCl濃度處理下，WT和AS-12根細(xì)胞伊文思藍(lán)染色程度對(duì)比，從左至右分別表示為0，50，100，150 mM NaCl處理后根染色程度對(duì)比Fig.4 Visible observations of root of wild-type(WT)and AOX anti-sense(AS-12)Arabidopsis seedlings when stained by Evans blue under different NaCl treatments.The roots were exposed to 0 mM，50 mM，100 mM，or 150 mM NaCl

圖5 不同外源過氧化氫處理下WT和AS-12擬南芥根生長速率比較Fig.5 The comparison of the rate of root growth between wild-type(WT Col-0)and AOX anti-sense(AS-12)Arabidopsis seedlings treated with exogenousH2O2

在50 mM H2O2處理下，WT和AS-12根細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞死亡，但AS-12細(xì)胞死亡程度嚴(yán)重，隨著H2O2濃度遞增，AS-12與WT細(xì)胞死亡程度均逐漸增加，但在100和200 mM H2O2處理下擬南芥細(xì)胞死亡程度基本相似(圖6)。

圖6 不同H2O2濃度處理下，WT和AS-12根細(xì)胞伊文思藍(lán)染色程度對(duì)比，從左至右分別表示為0，50，100，200 mM H2O2處理后根染色程度對(duì)比Fig.6 Visible observations of root of wild-type(WT Col-0)and AOX anti-sense(AS-12)Arabidopsis seedlings when stained by Evans blue under different H2O2treatments.The roots were exposed to 0 mM，50 mM，100 mM，or 200 mM H2O2

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，WT和AS-12兩種擬南芥在沒有受到鹽脅迫時(shí)，其生長速率沒有顯著差異(圖2A)。鹽脅迫導(dǎo)致了兩種擬南芥根的生長抑制(圖3)。在50或100 mM NaCl鹽脅迫下，AS-12擬南芥根的生長速率低于WT擬南芥(圖3)，說明在一定水平的鹽脅迫下，交替氧化酶編碼基因表達(dá)的缺失會(huì)造成植株根生長的進(jìn)一步抑制，表明了交替氧化酶能夠在一定程度上抵抗鹽脅迫所造成的根的生長抑制。

在未遭鹽脅迫情況下，WT和AS-12兩種擬南芥根細(xì)胞的活力并沒有明顯差別(圖2B)，然而，在含有50或100 mM NaCl的培養(yǎng)基上生長的AS-12根細(xì)胞死亡程度較之WT更加明顯(圖4)，這說明了交替氧化酶在一定的鹽脅迫條件下可以緩解鹽脅迫所引起的細(xì)胞死亡。該結(jié)果與根的生長速率實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合;且研究表明，鹽脅迫所導(dǎo)致的植物根生長抑制主要和根部細(xì)胞死亡有關(guān)［8-9］。這提示了在鹽脅迫下交替氧化酶基因的缺失所導(dǎo)致的擬南芥根生長速率減緩很可能是細(xì)胞活力降低的結(jié)果。

目前，很多研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下活性氧含量的增加是造成細(xì)胞死亡的主要因素［9］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 mM H2O2處理擬南芥幼根僅8 h就造成了幼根的生長抑制和明顯的細(xì)胞死亡(圖4和5)。在50 mM H2O2處理擬南芥幼根8 h后，AS-12擬南芥根的生長速率低于WT擬南芥，而細(xì)胞死亡程度高于WT擬南芥(圖5和圖6)。說明活性氧也可以誘導(dǎo)根的生長抑制和細(xì)胞死亡，而交替氧化酶也可以在一定程度上減緩這種誘導(dǎo)作用。

如前文所述，鹽脅迫下細(xì)胞中活性氧含量的增加能夠引起組織的細(xì)胞死亡［10］。外源過氧化氫處理也被報(bào)道能夠引起細(xì)胞死亡，其原因也被認(rèn)為是引起細(xì)胞內(nèi)過氧化氫含量上升的結(jié)果［11］。而細(xì)胞內(nèi)活性氧上升造成細(xì)胞死亡的內(nèi)在原因可能包括了活性氧對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子的損傷以及所引發(fā)的基因表達(dá)的改變等［12］。交替氧化酶目前被確認(rèn)的功能之一是降低細(xì)胞活性氧的生成［13］。因此，在鹽脅迫或外源過氧化氫處理下交替氧化酶編碼基因的缺失所造成的更為明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象應(yīng)被歸結(jié)于交替氧化酶降低活性氧能力。而根的生長抑制是根組織細(xì)胞死亡的必然結(jié)果，所以交替氧化酶編碼基因缺失的擬南芥在鹽脅迫或外源過氧化氫處理下出現(xiàn)了更為低速的生長。

但應(yīng)該注意到，在較高水平的鹽脅迫或過氧化氫處理下(如150 mM NaCl或200 mM H2O2)，野生型和交替氧化酶基因缺失型擬南芥根的細(xì)胞死亡程度均達(dá)到了較高水平，且生長速率也均受到較大抑制，擬南芥的根的細(xì)胞死亡和生長速率均無明顯區(qū)別，猜測(cè)這種高水平的脅迫壓力可能已經(jīng)超出了交替氧化酶維持細(xì)胞活力的能力。

綜上，在一定的鹽脅迫或外源過氧化氫處理下，交替氧化酶能夠在一定程度上緩解細(xì)胞死亡和根的生長抑制，其作用機(jī)理可能與交替氧化酶降低體內(nèi)的活性氧的能力有關(guān)。

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