申衛(wèi)博，張雪冰，王國棟

(1.西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，陜西楊凌 712100;2.中國科學院水利部水土保持研究所/黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學理學院，陜西楊凌 712100)

石油是人類最主要的能源之一，被稱作工業(yè)的血液、黑色的金子。隨著石油需求量增加，大量的石油及其加工品進入土壤，給人類和環(huán)境帶來巨大的危害。在石油開采、運輸及儲存過程中都會造成土壤的污染，油田周圍大面積的土壤和水域一般都受到石油污染，造成河流濕地受到嚴重污染［1］。石油污染土壤不僅影響農(nóng)作物生長，而且石油烴不易被土壤吸附的成分會滲透到地下水，影響飲用水的水質(zhì)［2］，進而通過水和土壤轉(zhuǎn)移到生物體，對人類造成危害［3-4］。

對石油污染土壤進行治理，使其在較短時間內(nèi)恢復到可耕作的標準，對于發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有非常重要的意義，特別是微生物降解方法［5］進行生物治理。微生物修復由于具有速度快、消耗少、不造成二次污染、費用低、原位降解污染物等特點，是一種極有前途的技術。因此篩選高效降解石油的微生物菌種，對用于處理石油污染的土壤，將產(chǎn)生很大的社會效益和經(jīng)濟效益［6］。

微生物對石油污染的土壤的降解效果受土壤環(huán)境條件的影響［7］。因此要利用微生物修復石油污染的土壤，要先進行油污土壤中石油降解菌的分離與鑒定。本實驗選取毛烏素沙地典型湖濱濕地作為研究對象，研究了油污濕地的理化性質(zhì)，并對存在的石油降解菌進行了分離鑒定，旨在為該地域的微生物修復油污濕地提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集 2006—2013年，于毛烏素沙漠地區(qū)雨季開始時期在巴嚇采當?shù)哪习豆策x擇9個點采集土壤樣品。自湖邊向湖外圍進行取樣，分別在距湖邊1 m，10 m和50 m處采樣。每個采樣點取3個重復，采集土樣厚度為0～30 cm，分為0～5 cm，5～10 cm 和10～20 cm 三層。將采集的土壤樣品封存于無菌塑料袋中，在4℃保存。土壤樣品帶回實驗室后立即進行石油降解菌的分離培養(yǎng)。土壤理化性質(zhì)的測定采用風干土壤樣品進行。

表1 巴嚇采當湖濱各采樣點的基本情況Tab.1 General situation of sample sites in Baxiacaidang Lake

1.1.2 石油降解菌分離培養(yǎng)基［6］A.石油降解富集培養(yǎng)基:MgS04`7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.02 g，K2HP04l g，KH2PO41g，NH4N03l g，酵母膏 l g，蒸餾水l L，微量元素液0.5%，F(xiàn)eCl30.05 g，pH值7.0～7.2，原油5%。

B.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏2.5 g，蛋白胨 5 g，NaCl 2.5 g，蒸餾水500 mL，pH 值7.2-7.4。

C.血平板:在121℃下將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基滅菌15 min，冷卻至50℃后以1∶20加入脫纖維羊血(北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司)，搖勻后傾注培養(yǎng)基平板上。

D.油平板:將原油溶于25%石油醚中，將石油醚均勻涂布于無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，每個平板加1.0 mL原油溶液，待石油醚揮發(fā)石油凝固后即成油平板。

E.無機鹽固體培養(yǎng)基:MgS04`7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.01 g，KH2PO40.5g，K2HP040.5g，NH4N030.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸餾水 500mL，微量元素液0.5%，F(xiàn)eCl30.03 g，瓊脂9g，pH值7.0～7.2。

1.2 巴嚇采當土壤理化性質(zhì)的測定［8］

土壤有機質(zhì)含量的測定采用重絡酸鉀外加熱容量法，全氮含量的測定采用半微量凱氏定氮法，速效氮含量的測定采用2mol·L-1KCl侵提——靛酚藍比色法測定，全磷含量采用HClO4-H2SO4法，速效磷含量的測定采用0.5 mol·L-1NaHCO3侵提——鉬銻抗比色法。土壤pH值采用pH計測定(m(土)∶V(水)=1.0∶2.5)。

1.3 石油降解菌的分離與鑒定

1.3.1 分離［6］9個采樣點各秤取5g土樣，利用石油降解菌富集培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)7d。培養(yǎng)條件為30℃下180r/min。取富集液10mL接到富集培養(yǎng)基中再發(fā)酵7 d。如此循環(huán)培養(yǎng)4次后，將富集液稀釋為 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和 10-8共 8 個稀釋度，取 10-6，10-7，10-83個稀釋度各0.1mL涂布于血平板上，放置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h觀察。利用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)血平板上溶血圈較明顯的菌落2d，培養(yǎng)條件為30℃下180r/min。按上述方法進行梯度稀釋，取10-6，10-7，10-83個稀釋度各0.1mL涂布于油平板，37℃恒溫培養(yǎng)2 d。利用牛肉膏蛋白胨平板分離油平板上噬油斑較明顯的菌株，分離成單菌落。

1.3.2 鑒定［9］菌體DNA的分離純化使用試劑盒，提取石油降解菌的基因組總DNA。

PCR反應的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。16S rDNA由上海生物工程技術有限公司測序完成。

序列同源性分析:序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTN比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件和SigmaPlot軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 巴嚇采當湖濱土壤基本理化性質(zhì)分析

對巴嚇采當9個采樣點土壤的基本理化性質(zhì)進行測定，結果見表2。由表2可見，巴嚇采當?shù)貐^(qū)土壤pH值大都在7.0以下，為偏酸性土壤。由表2可看出，蘆葦?shù)?、草木樨地和沙柳地的有機質(zhì)含量隨土壤深度增加呈降低趨勢，有機質(zhì)含量為3.47～72.36g/kg，西北地區(qū)土壤有機質(zhì)含量一般在 6.0 ～10.0g/kg［10］，說明巴嚇采當?shù)貐^(qū)有機質(zhì)含量整體較高，這與濕地富營養(yǎng)化及周圍農(nóng)田化肥污染相關。在0～5 cm層土壤有機質(zhì)含量為草木樨＞蘆葦＞沙柳，在5～10 cm層土壤有機質(zhì)含量為蘆葦＞草木樨＞沙柳，10～20 cm層土壤有機質(zhì)含量為草木樨＞蘆葦＞沙柳。蘆葦?shù)睾筒菽鹃赝寥烙袡C質(zhì)含量較高，可能是因含有大量腐殖質(zhì)。巴嚇采當土壤硝態(tài)氮含量為2.57～14.19mg/kg，銨態(tài)氮含量為16.53～37.45mg/kg，土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量隨土壤深度增加呈先降低后升高的趨勢。全磷含量為0.28～1.04g/kg，土壤全磷含量與有機質(zhì)變化趨勢基本一致，利用SPSS做相關分析，相關系數(shù) R=0.9750(p=0.01)，呈顯著正相關。速效磷含量為3.93～10.26mg/kg，比張姍姍［11］研究紅堿淖速效磷含量高，可能與巴嚇采當周圍農(nóng)田使用磷肥有關。綜上分析可知，巴嚇采當湖濱土壤為酸性土壤，土壤養(yǎng)分比紅堿淖湖濱土壤高。

2.2 巴嚇采當湖濱土壤石油降解菌的篩選和鑒定

16S rDNA序列的測定結果用BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進行同源性比較，結果表明，3-12與5-3都與炭疽桿菌(Bacillus anthraci)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)親緣關系較近，同源性均達到99%。經(jīng)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育學分析確定，可以將3-12鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，5-3為蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)。3-12和5-3系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。

表2 巴嚇采當湖濱土壤的基本理化性質(zhì)Tab.2 Soil physic-chemical properties in Baxiacaidang Lakeside

圖1 石油降解菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rDNA sequence homology analysis of oil degradation bacteria degradation strain

3 結論

1)巴嚇采當?shù)貐^(qū)土壤為酸性土壤。土壤有機質(zhì)、全磷、速效磷等含量較高，這可能與水體富營養(yǎng)化及周邊農(nóng)田化肥污染有關。

2)巴嚇采當土壤與紅堿淖土壤相比，土壤酸堿性不同。巴嚇采當為酸性土壤，紅堿淖為堿性或強堿性土壤。巴嚇采當土壤的有機質(zhì)、全磷等含量高于紅堿淖。

3)巴嚇采當土壤經(jīng)分離篩選后得出兩種石油降解菌，即蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌。

本次實驗對毛烏素沙地典型湖濱濕地——巴嚇采當土壤的理化性質(zhì)、石油降解菌資源做了初步調(diào)查，結果為該地區(qū)有機質(zhì)、全磷等含量比紅堿淖較高，為解決濕地石油污染，改良土壤奠定基礎。在后續(xù)的實驗中，筆者將采用室內(nèi)培養(yǎng)模擬實驗的方法，針對土壤、環(huán)境等因子對石油降解菌降解石油效果的影響機理及適合沙地石油降解菌最優(yōu)配比做出進一步研究。

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