任敏+單哲+許聯(lián)紅

【摘要】 目的：探討特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）患者外周血淋巴細(xì)胞CD28、CD80及CD86的表達(dá)及意義。方法：采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測30例ITP患者和30例健康對照者外周血CD28細(xì)胞、CD80細(xì)胞和CD86細(xì)胞分別占淋巴細(xì)胞的比例及血小板表面相關(guān)抗體水平，并進(jìn)行對比、分析。結(jié)果：與正常對照組相比，ITP患者外周血CD28細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CD80細(xì)胞增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CD86細(xì)胞顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），此結(jié)果與ITP是否急慢性無關(guān)。治療前后患者的CD28、CD80及CD86的表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?；颊吲c正常對照組PAIgA、PAIgG和PAIgM的水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CD80、CD86表達(dá)與PAIgG水平之間存在顯著的相關(guān)性，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：ITP患者外周血淋巴細(xì)胞CD28、CD80及CD86表達(dá)均異常，可能與其發(fā)病相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 免疫性血小板減少癥； CD28； CD80； CD86

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一類以血小板數(shù)量減少為主要特點的出血性疾病，其表現(xiàn)為血小板壽命縮短，骨髓象見骨髓巨核細(xì)胞數(shù)目增多，一般脾臟無明顯腫大[1]。目前的研究表明，該類疾病患者存在免疫反應(yīng)異常，導(dǎo)致其體內(nèi)產(chǎn)生血小板抗體（PAIg），引起血小板被巨噬細(xì)胞破壞增加。而有研究顯示，T、B淋巴細(xì)胞的免疫異常與ITP的發(fā)病密切相關(guān)，包括其活化、增殖、凋亡異常等方面，而在這一過程中協(xié)同刺激分子（CD28、CD80、CD86）的作用顯得尤為重要[2-3]。為了探討ITP發(fā)病的免疫相關(guān)機(jī)制，筆者采用免疫熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞技術(shù)檢測ITP患者外周血淋巴細(xì)胞中CD28、CD80、CD86的表達(dá)，并檢測ITP患者血小板抗體（PAIgA、PAIgG和PAIgM）水平，分析其與協(xié)同刺激分子表達(dá)改變的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月-2014年6月間本院門診及住院的ITP患者30例，診斷均符合第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]。選擇30例近期無感染、肝炎、結(jié)核的健康志愿者作為正常對照組，ITP組年齡18～75歲，中位年齡46歲，其中男16例，女14例，急性18例，慢性18例，采集標(biāo)本時血小板數(shù)為（2～45）×109/L，未行脾切除治療。正常對照組年齡18～70歲，中位年齡42歲，其中男15例，女15例，采集標(biāo)本時血小板為正常，所有研究對象采血時均未接受血小板輸注。

1.2 材料及試劑 FACSCalibur型流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。單克隆抗體CD4-APC，CD28-PE，CD80-FITC，CD86-PE，CD19-APC及其陰性對照均購于美國BD Pharmingen公司。

1.3 方法

1.3.1 CD28、CD80、CD86的檢測 （1）標(biāo)本采集：采集受檢者空腹靜脈血2 mL， EDTA-K2抗凝。（2）單克隆抗體標(biāo)記：分別取100 μL抗凝血放入3支驗管和1支對照管，實驗管分別加20 mL CD28-PE、CD80-PE、CD86-PE，對照管加20 mL鼠抗人IgG1-PE，室溫避光孵育30 min，加入細(xì)胞裂解液2 mL混勻，靜置8 min，300 g離心5 min。（3）棄上清，加入PBS緩沖液，混勻200 g離心5 min。（4）棄上清，每管加入250 mL鞘液，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。（5）協(xié)同刺激分子的檢測：用前向角散射和側(cè)向角散射散點圖區(qū)分細(xì)胞群體，用門圈出分析的淋巴細(xì)胞群體。每份標(biāo)本檢測20 000個細(xì)胞。計算CD28、CD80及CD86陽性細(xì)胞比例。

1.3.2 血小板相關(guān)抗體（PAIg）檢測 采用酶聯(lián)免疫法測定PAIg，抽取受檢者靜脈血4 mL，EADT-Na2抗凝，分離血小板，按ELISA法試劑盒操作說明書進(jìn)行PAIg檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

有研究顯示，在ITP患者體內(nèi)可檢測到血小板的自身抗體，這些抗體能夠與血小板的表面抗原結(jié)合，與巨噬細(xì)胞Fc受體相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對血小板的清除，引起血小板的減少[4]。目前已有試驗證實，T淋巴細(xì)胞在ITP患者體內(nèi)的異?；罨?，導(dǎo)致了自身抗血小板抗體的產(chǎn)生，從而引起ITP發(fā)病[5]。

在T細(xì)胞的活化過程中，需要兩個信號進(jìn)行刺激，一個是來自抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面的MHC-Ag復(fù)合體，其通過T細(xì)胞上的TCR/CD3傳遞給T細(xì)胞的初始激活信號。另一個則是協(xié)同刺激信號，該類協(xié)同刺激因子是由APC和T細(xì)胞表面的黏附分子相互作用所提供的。目前研究所發(fā)現(xiàn)的最重要的協(xié)同刺激因子是CD80、CD86與CD28，CD80、CD86作為受體，廣泛存在于抗原遞呈細(xì)胞（APC）上，如B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞，而CD28則是T淋巴細(xì)胞上的相應(yīng)配體[6]。CD28屬于免疫球蛋白超家族成員，其定位于染色體2q33區(qū)[7-8]。它主要表達(dá)于T細(xì)胞和漿細(xì)胞表面。通過CD28/B7分子對T細(xì)胞的協(xié)同刺激作用可增強(qiáng)IL-2基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)IL-2合成[9]。另外，CD28分子所啟動的胞內(nèi)信號還可促進(jìn)Bcl-XL表達(dá)從而保護(hù)T細(xì)胞免于凋亡[10]。趙艷霞等[11]發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血CD4+CD28+細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，從而使T細(xì)胞易被誘導(dǎo)凋亡因素激活而凋亡。

根據(jù)McMillan R等[12]的研究報道，ITP發(fā)病時B細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗血小板自身抗體，該抗體的產(chǎn)生受Th細(xì)胞及他們產(chǎn)生的細(xì)胞因子所控制，因此，在ITP的發(fā)病過程中存在Th1/Th2的平衡紊亂以及細(xì)胞因子的異常分泌，從而使B細(xì)胞出現(xiàn)活化異常進(jìn)而產(chǎn)生抗血小板抗體，最終導(dǎo)致ITP的發(fā)病。有文獻(xiàn)[13]報道ITP患者存在T細(xì)胞亞群Th1/Th2失衡，而B細(xì)胞表面的CD80、CD86表達(dá)率明顯上升，從而提示兩者在ITP發(fā)病機(jī)制中起一定作用。endprint

筆者的研究結(jié)果顯示，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示ITP患者T細(xì)胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD80的表達(dá)率均偏高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關(guān)，CD86的表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這與相關(guān)文獻(xiàn)[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達(dá)率與PAIgG的相關(guān)性分析證明了由于ITP患者的B細(xì)胞活化異常，導(dǎo)致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結(jié)合，因此與血小板結(jié)合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達(dá)率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復(fù)，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應(yīng)的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細(xì)胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達(dá)到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻(xiàn)

[1]張之南.血液病診斷及診療標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關(guān)抗體和淋巴細(xì)胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)和意義[J].臨床血液學(xué)雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達(dá)與血小板抗體關(guān)系的臨床研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進(jìn)才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細(xì)胞對血細(xì)胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權(quán)，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細(xì)胞及其與IL-18的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關(guān)秀茹，馬學(xué)華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達(dá)[J].中國免疫學(xué)雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻(xiàn)血反應(yīng)率的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文編輯：陳丹云）endprint

筆者的研究結(jié)果顯示，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示ITP患者T細(xì)胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD80的表達(dá)率均偏高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關(guān)，CD86的表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這與相關(guān)文獻(xiàn)[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達(dá)率與PAIgG的相關(guān)性分析證明了由于ITP患者的B細(xì)胞活化異常，導(dǎo)致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結(jié)合，因此與血小板結(jié)合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達(dá)率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復(fù)，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應(yīng)的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細(xì)胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達(dá)到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻(xiàn)

[1]張之南.血液病診斷及診療標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關(guān)抗體和淋巴細(xì)胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)和意義[J].臨床血液學(xué)雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達(dá)與血小板抗體關(guān)系的臨床研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進(jìn)才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細(xì)胞對血細(xì)胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權(quán)，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細(xì)胞及其與IL-18的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關(guān)秀茹，馬學(xué)華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達(dá)[J].中國免疫學(xué)雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻(xiàn)血反應(yīng)率的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文編輯：陳丹云）endprint

筆者的研究結(jié)果顯示，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示ITP患者T細(xì)胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細(xì)胞CD80的表達(dá)率均偏高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關(guān)，CD86的表達(dá)率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這與相關(guān)文獻(xiàn)[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達(dá)率與PAIgG的相關(guān)性分析證明了由于ITP患者的B細(xì)胞活化異常，導(dǎo)致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結(jié)合，因此與血小板結(jié)合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達(dá)率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復(fù)，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應(yīng)的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細(xì)胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達(dá)到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻(xiàn)

[1]張之南.血液病診斷及診療標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關(guān)抗體和淋巴細(xì)胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)和意義[J].臨床血液學(xué)雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達(dá)與血小板抗體關(guān)系的臨床研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進(jìn)才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細(xì)胞對血細(xì)胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權(quán)，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細(xì)胞及其與IL-18的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關(guān)秀茹，馬學(xué)華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達(dá)[J].中國免疫學(xué)雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻(xiàn)血反應(yīng)率的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文編輯：陳丹云）endprint