韋艷霞+劉佃濱+鄭紀偉+等
【摘要】 目的:對雙歧桿菌屬編碼的Ⅱ類毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)MazEF進行分子進化分析。方法:利用PSI-BLAST在NCBI中搜索獲得雙歧桿菌編碼的MazF分子序列,在NCBI蛋白數據庫、核酸數據庫分別下載其他菌屬基因組編碼的MazF蛋白序列和本研究所涉及菌屬的16 S rRNA序列,應用Clustal X2和MEGA4軟件對MazF做分子進化分析。結果:共搜索到雙歧桿菌株染色體編碼毒素蛋白MazF 26個。分子進化分析顯示:整個雙歧桿菌屬的MazF保守性不好;MazF與16 S rRNA的共進化僅在個別菌種中發(fā)現,大部分MazF的聚類結果與相應菌種16 S rRNA的聚類結果不同。結論:雙歧桿菌中的TA系統(tǒng)MazEF可能是通過基因的水平轉移整合入基因組中,屬于菌株非核心基因組部分。
【關鍵詞】 MazEF; 毒素-抗毒素系統(tǒng); 分子進化; 雙歧桿菌
Ⅱ類毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng),最早在1982年于大腸埃希菌的低拷貝質粒中發(fā)現。其后發(fā)現,TA系統(tǒng)同樣存在于細菌染色體上,也存在于一些外源DNA島如噬菌體、轉座子、超級內含子和質粒中,由于近年來發(fā)現其參與細菌的多種應激調控過程而被廣泛關注[1]。生物信息學分析發(fā)現:多達750個細菌和古細菌的基因組中存在Ⅱ類TA系統(tǒng);自生微生物的基因組中一般含有多個Ⅱ類TA系統(tǒng)編碼基因,而在嚴格的胞內微生物基因組中未發(fā)現Ⅱ類TA系統(tǒng)編碼基因;以上證據提示Ⅱ類TA系統(tǒng)對微生物的生存具有重要作用。主流觀點認為:TA系統(tǒng)可能作為一個特殊的壓力反應原件,在細菌對不利環(huán)境的應激調控過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。根據TA系統(tǒng)中氨基酸序列的相似度,Ⅱ類TA中的毒素蛋白被分為9個家族,包括CcdB、RelE、MazF、ParE、Doc、VapC、ζ、HipA以及HigB[3]。根據毒素蛋白的分類,相應TA系統(tǒng)被分為9類。其中,MazEF是最早在大腸埃希菌基因組中發(fā)現、研究最為深入的Ⅱ類TA系統(tǒng)之一,參與細菌對營養(yǎng)饑餓、抗生素、高溫、DNA損傷等應激反應調控[1,4]。
雙歧桿菌(Bifidobacterium)是母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道中的優(yōu)勢菌,具有對宿主多方面的益生作用,如拮抗腸道病原體、調節(jié)免疫、平衡腸道菌群等[5-20]。作為一種模式益生菌,雙歧桿菌經常與其他乳酸菌一起用于益生菌制品的生產,在食品、醫(yī)藥、畜牧等領域應用廣泛。作為益生菌使用的雙歧桿菌在工業(yè)加工、儲藏、運輸以及進入宿主胃腸道的過程中會遭遇各種環(huán)境脅迫,如酸、熱、氧氣、營養(yǎng)匱乏和高滲透壓等各種不利刺激。目前,已經有近40株雙歧桿菌進行了全基因組測序,但是它們的基因組中是否存在MazEF、它們分子的進化關系如何、是否參與雙歧桿菌對多種不利環(huán)境的應激調控均不清楚。由于構成TA系統(tǒng)的一對毒素蛋白(MazF)和抗毒素蛋白(MazE)處于共進化的狀態(tài),MazF的進化狀態(tài)可以代表TA系統(tǒng)MazEF的進化狀態(tài)[21]。因此,本研究通過對雙歧桿菌MazF的進化分析間接研究MazEF的分子進化。作者在NCBI數據庫中獲得雙歧桿菌編碼的MazF,對其進行多序列比對;進一步將來自雙歧桿菌屬和其他菌屬的毒素蛋白MazF和菌株16 S rRNA的進化分析結果進行比較,完成對雙歧桿菌MazEF的分子進化分析。
1 資料與方法
1.1 一般資料 MazF蛋白和16 S rRNA序列菌株來源均下載自NCBI,包括B. longum,B. breve,B. stellenboschense,B.ruminantium, B. kashiwanohense, B. bifidum, Streptococcus mutans, Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus johnsonii。
1.2 方法 MazF蛋白和16 S rRNA序列獲取通過PSI-BLAST在NCBI中搜索,獲得雙歧桿菌染色體編碼的MazF;通過NCBI蛋白數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)下載其他菌屬染色體編碼的6個MazF序列;而16 S rRNA序列下載自NCBI核酸數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)。
1.3 統(tǒng)計學處理 分別應用Clustal X2和MEGA4軟件進行多序列比對和進化圖繪制。
2 結果
2.1 雙歧桿菌染色體編碼MazF情況 共搜索到雙歧桿菌染色體編碼毒素蛋白MazF 26個。其中,21個MazF編碼基因存在于B. longum、B. breve染色體上,其余位于其他5種雙歧桿菌染色體中,見表1。雙歧桿菌中MazF蛋白序列由99~129個氨基酸構成,見圖1。
2.2 MazF分子進化分析 通過Clustal X2對26個雙歧桿菌染色體上的MazF蛋白分子進行多序列比對,結果如圖1。選取來自6種雙歧桿菌的代表性MazF蛋白序列和其他菌株MazF進化分析,并將結果與16 S rRNA分子進化分析結果相比較見圖2。
3 討論
TA系統(tǒng)通常由處在同一個操縱子中緊密連鎖的兩個基因組成;其中一個基因編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白或RNA,另一個基因編碼相對穩(wěn)定的毒素蛋白。根據抗毒素的成分不同,通常將TA系統(tǒng)分為三類:Ⅰ類的抗毒素為反義mRNA,Ⅱ類的抗毒素基因編碼抗毒素蛋白。前者可以抑制毒素蛋白mRNA的翻譯,從而阻止毒素蛋白發(fā)揮作用;后者可以與毒素蛋白結合形成蛋白復合體,達到抑制毒素的作用。而III類TA系統(tǒng)中的抗毒素雖然也是RNA,但是其抑制毒素作用的機制與Ⅱ類不同,它是通過抗毒素與毒素蛋白形成RNA-蛋白質結構發(fā)揮毒素抑制作用[22]。
MazEF是最早于大腸埃希菌基因組中發(fā)現的Ⅱ類TA系統(tǒng),由處于同一操縱子、緊密連鎖的兩個基因mazE和mazF編碼。上述兩個基因均編碼小分子蛋白,其中mazE編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白,mazF編碼相對穩(wěn)定的毒素蛋白[23]。一般情況下,MazE和MazF形成蛋白復合體,處于動態(tài)平衡狀態(tài),細菌正常生長。由于MazE沒有MazF穩(wěn)定,需要不斷的合成MazE維持平衡狀態(tài),因此在某些情況下,如氨基酸饑餓、抗生素等不利刺激下,MazE被降解或合成受到抑制,其含量相對于MazF減少,從而引起細菌的死亡或生長抑制[24]。研究發(fā)現:MazEF參與氨基酸饑餓、高溫和DNA損傷等惡劣環(huán)境下菌株的應激調控,在細菌壓力調控過程中發(fā)揮重要作用[1,24]。
雙歧桿菌MazF多序列比對分析雖然發(fā)現了雙歧桿菌MazF的保守區(qū)域(黑色、灰色區(qū)域),然而整個雙歧桿菌屬基因組上的MazF保守性不好,僅個別菌種內的MazF具有較好的保守性,如B. breve基因組上的MazF保守性較好。進一步分子進化分析顯示:MazF的聚類結果與相應菌種16 S RNA的聚類結果不一致,MazF與16 S RNA的共進化僅在個別菌種中發(fā)現,如B. breve和B. longum中的MazF。上述結果提示:雙歧桿菌中的MazEF可能是通過基因的水平轉移整合入基因組中,屬于菌株的非核心基因組部分,具有較大的流動性。上述編碼MazEF的雙歧桿菌株可能具有某些不利環(huán)境下的生存優(yōu)勢。
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(收稿日期:2014-07-28) (本文編輯:王宇)
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