肺癌在我國(guó)已經(jīng)成為癌癥死亡的首要病因。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來(lái)的天然化合物，其分子式為C12H28O6，具有抗腫瘤活性，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[1]。本文旨在探討冬凌草甲素促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1資料

肺癌細(xì)胞株NCI-H460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。冬凌草甲素（純度≥98%）購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。RPMI 1640購(gòu)自Gibco公司；噻唑藍(lán)（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）及二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司；兔抗鼠IgG抗體及鼠抗人β-actin、livin、survivin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；Western-blot Luminol(ECL)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)NCI-H460肺癌細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組，分布加入冬凌草甲素使終濃度為0、8、16、24μmol/L。

2.2凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察采用Hoechst33342/PI熒光雙重染色。培養(yǎng)細(xì)胞中加入Hoechst33342，終濃度為5μg/ml，37℃避光染色10min，加入PI染液，終濃度為15μg/ml，4℃避光反應(yīng)10min，熒光顯微鏡下觀察。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集1×105個(gè)細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，細(xì)胞重懸后Hoechst33342/PI染色，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。其中活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，凋亡細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，壞死細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

2.4 Western blot檢測(cè)livin、survivin表達(dá)收集4組細(xì)胞，將每組細(xì)胞1×106個(gè)裂解，提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度；用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1h，加入鼠抗人β-actin、livin、survivin抗體，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，進(jìn)行ECL反應(yīng)顯影并曝光，用Quality One軟件分析條帶相對(duì)吸光度值（靶蛋白吸光度/β-actin吸光度），比較蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。多組資料間的比較用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3結(jié)果

3.1凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組僅有很低的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)有較強(qiáng)綠色熒光的凋亡細(xì)胞和有紅綠雙重?zé)晒獾膲乃兰?xì)胞。凋亡細(xì)胞變圓或皺縮，細(xì)胞膜完整，部分細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮成塊狀、分葉狀或形成粗細(xì)不均勻的碎塊并相互分離，不均勻地分散于細(xì)胞質(zhì)中，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，形成凋亡小體。說(shuō)明冬凌草甲素具有促進(jìn)NCI-H460細(xì)胞凋亡的作用。

3.2細(xì)胞凋亡率檢測(cè)冬凌草甲素作用24h、48h、72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組（P<0.05），表明冬凌草甲素能有效誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡，低濃度組、中濃度組和高濃度組之間凋亡率有顯著性差異，隨冬凌草甲素濃度的增大，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)升高，表明冬凌草甲素誘導(dǎo)NCI-H460細(xì)胞凋亡的作用具有劑量依賴(lài)性（圖1）。

圖1 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

3.3 Western blot檢測(cè)livin、survivin表達(dá)4組均有survivin和livin的不同程度的表達(dá)，以靶蛋白吸光度/β-actin吸光度的比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組survivin和livin的表達(dá)均低于對(duì)照組（P<0.01）。隨著冬凌草甲素濃度的升高，livin與survivin的表達(dá)逐漸降低，高濃度組表達(dá)survivin及l(fā)ivin水平最低（表1）。表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460細(xì)胞中survivin和livin蛋白表達(dá)，其抑制作用與冬凌草甲素濃度相關(guān)。

4 討論

尋找有效的抗腫瘤藥物對(duì)于肺癌的治療具有極其重要的意義。冬凌草甲素是從冬凌草中提取出來(lái)的二萜類(lèi)化合物，其分子式為C12H28O6，具有明顯的抗腫瘤活性，能夠抑制肝癌、胃癌、食管癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-KB（NF-KB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）[2]、表皮生長(zhǎng)因子受體等相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。目前已有冬凌草甲素對(duì)肺癌細(xì)胞作用的報(bào)道，研究顯示冬凌草甲素能誘導(dǎo)A549細(xì)胞和SPCA-1的凋亡，但是冬凌草甲素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

Livin和survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），僅特異性的表達(dá)于腫瘤和胚胎組織中。兩者都含有抑制caspase蛋白酶的結(jié)構(gòu)域，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，在食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可以與caspase-9直接結(jié)合或與輔助性線粒體源性caspase激活因子結(jié)合間接抑制caspase活性而抗凋亡。Livin是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的IAP，在食管癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。Livin與caspase結(jié)合后，可以阻止caspase蛋白執(zhí)行蛋白切除功能，從而抑制細(xì)胞凋亡。

本研究中發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素作用于NCI-H460細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，經(jīng)冬凌草甲素干預(yù)的NCI-H460細(xì)胞livin和survivin蛋白表達(dá)明顯降低，表明冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用與livin和survivin表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

本課題通過(guò)體外研究，表明冬凌草甲素能誘導(dǎo)NCI-H460肺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制NCI-H460肺癌細(xì)胞表達(dá)livin和survivin，為冬凌草甲素用于肺癌治療提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]車(chē)憲平，韓瑞發(fā)，肖進(jìn)逐，等.冬凌草甲素和冬凌草多糖膀胱灌注治療C57BL/6小鼠膀胱腫瘤的療效及機(jī)制[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(7):1410-1412.

[2]Bu HQ， Luo J， Chen H， et al. Oridonin enhances antitumor activity of gemcitabine in pancreatic cancer through MAPK-p38 signaling pathway[J]. Int J Oncol， 2012，41(3):949-958.

[3]Gao FH， Liu F， Wei W， et al. Oridonin induces apoptosis and senescence by increasing hydrogen peroxide andglutathione depletion in colorectal cancer cells[J]. Int J Mol Med， 2012， 29(4):649-655.

編輯/孫杰