摘要：目的通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)新型解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）核酸檢測(cè)試劑（采用一步法處理樣本，以下簡(jiǎn)稱(chēng)\"一步法\"）的臨床使用進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法用一步法試劑與煮沸法試劑對(duì)176例臨床收集的樣本進(jìn)行UU DNA檢測(cè)并對(duì)比其結(jié)果，同時(shí)，將兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果分別與培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果新型解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑與煮沸法試劑的陽(yáng)性一致性百分比為99.00%，陰性一致性百分比為96.05%，總一致性百分比為97.73%；對(duì)4例不符樣本進(jìn)行測(cè)序復(fù)核，并對(duì)復(fù)核后的結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)一致性分析，結(jié)果Kappa值=1.000，表明新型試劑的檢測(cè)結(jié)果與煮沸法試劑及復(fù)核檢測(cè)的結(jié)果具有很好的一致性。在與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比中，兩種試劑均表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確性。結(jié)論新型解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑與已上市煮沸法試劑的檢測(cè)結(jié)果陰陽(yáng)性一致性較好，操作簡(jiǎn)單快速，減少污染環(huán)節(jié)，并具有內(nèi)標(biāo)控制假陰性，靈敏度更高，結(jié)果準(zhǔn)確，符合臨床檢測(cè)要求，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：解脲脲原體；UU DNA；熒光定量PCR；一步法；煮沸法解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）是一類(lèi)原核細(xì)胞微生物，體積介于細(xì)菌與病毒之間，是引起泌尿生殖道感染的常見(jiàn)病原體[1]。UU感染不僅引起非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU），也可引起多種泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睪炎等，還被認(rèn)為是引起女性原因不明的不孕、流產(chǎn)以及死胎等的原因之一。由于UU感染臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，常易漏診，因此，快速、靈敏、特異的診斷方法是預(yù)防UU感染的關(guān)鍵[2]。目前解脲脲原體的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、基于核酸檢測(cè)的分子生物方法等。分離培養(yǎng)法的特異性和敏感性高，但其具有臨床檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（至少需要24~48 h，甚至更長(zhǎng)時(shí)間），過(guò)程繁瑣，需要使用特殊的培養(yǎng)介質(zhì)以及易受雜菌影響等缺陷，不適用于大范圍檢測(cè)。免疫學(xué)法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但受多種因素的影響，目前國(guó)內(nèi)也沒(méi)有商品化的試劑盒（僅有一個(gè)蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)獲得批準(zhǔn)認(rèn)證）。近年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反映患者治療前、后病原體變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染[3]。但目前國(guó)內(nèi)同類(lèi)試劑一般采用煮沸法提取核酸，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在操作過(guò)程中容易導(dǎo)致污染，而且大部分試劑沒(méi)有預(yù)防假陰性的內(nèi)標(biāo)控制和抗污染系統(tǒng)，影響檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。最近，新出現(xiàn)了一種一步法UU 核酸檢測(cè)試劑，它完全免去了核酸提取過(guò)程。根據(jù)其說(shuō)明，UU核酸經(jīng)常溫裂解后全部釋放參與到PCR反應(yīng)中，整個(gè)過(guò)程無(wú)污染、操作極其簡(jiǎn)單、迅速。本研究擬通過(guò)檢測(cè)臨床樣本，將其與市場(chǎng)上的煮沸試劑進(jìn)行比對(duì)，來(lái)評(píng)估這一新方法的準(zhǔn)確性及特異性。

1資料與方法

1.1一般資料 本次研究共檢測(cè)生殖道分泌物樣本176例，其中男性病例87例（49.4%），女性病例89（50.6%），-20℃冰箱保存。

1.2主要試劑和儀器 新型UU核酸檢測(cè)試劑購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司，采用一步法技術(shù)處理樣本（以下簡(jiǎn)稱(chēng)\"新型試劑\"或\"一步法試劑\"），具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控假陰性，最低檢測(cè)限為400 copies/mL；同時(shí)，選擇一種臨床使用客戶(hù)較多的國(guó)產(chǎn)UU核酸檢測(cè)試劑，采用煮沸法提取樣本核酸，沒(méi)有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控，作為對(duì)照試劑，最低檢測(cè)限為500 copies/mL。核酸擴(kuò)增儀采用美國(guó)Stratagene公司的Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3方法 分別采用兩種熒光定量PCR檢測(cè)試劑對(duì)176例臨床樣本（每例樣本一分為三，保留一份樣本作為復(fù)檢）進(jìn)行檢測(cè)，方法如下。

1.3.1煮沸法 取200 μL臨床樣本，12000 rpm離心5 min，去上清；向沉淀中加滅菌生理鹽水500 μL混勻，12000 rpm離心5 min，去上清；向沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12000 rpm離心5 min備用；取2 μL作為PCR反應(yīng)的模板，加入分裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2一步法 PCR反應(yīng)管中加入5 μL\"核酸釋放劑\"，加入5 μL標(biāo)準(zhǔn)品、待檢樣本，吸打混勻，加入40 μL PCR反應(yīng)液，吸打混勻上機(jī)檢測(cè)即可。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)進(jìn)行陰陽(yáng)性一致性分析，靈敏度、特異度分析和kappa檢驗(yàn)一致性分析。

2結(jié)果

2.1擴(kuò)增曲線(xiàn)對(duì)比，見(jiàn)圖1~3。

2.2根據(jù)煮沸法試劑檢測(cè)結(jié)果將臨床樣本分為陽(yáng)性組和陰性組，見(jiàn)表1。

2.3新型一步法試劑與煮沸法試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性性分析：

陽(yáng)性一致性百分比=A/(A+C)×100%=99 /（99+1）×100%＝99.00%；

陰性一致性百分比= D/(B+D)×100%=73 /（3+73）×100%＝96.05%；

總一致性百分比=(A+D)/(A+B+C+D) =（99+73）/176×100%＝97.73%

2.4新型一步法試劑與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表2。

靈敏度Se=TP/(TP+FN)×100%=97/(97+1)×100%=98.98%

特異度Sp=TN/(FP+TN)×100%=73/(5+73)×100%=93.59%

靈敏度Se+特異度Sp=98.98%+93.59%=192.57%>100%

2.5煮沸法試劑與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表3。

靈敏度Se=TP/(TP+FN)×100%=97(97+1)×100%=98.98%

特異度Sp=TN/(FP+TN)×100%=75/(3+75)×100%=96.15%

靈敏度Se+特異度Sp=98.98%+96.15%=195.13%>100%

2.6不符樣本的復(fù)核結(jié)果及其分析 根據(jù)結(jié)果，有4例樣本新型一步法試劑與煮沸法試劑檢測(cè)結(jié)果不符：其中3例煮沸法試劑檢測(cè)為陰性（檢測(cè)濃度處于400~1000 copies/mL且樣本性狀相對(duì)復(fù)雜），而新型一步法試劑檢測(cè)為陽(yáng)性（檢測(cè)濃度>400 copies/mL）；另1例煮沸法試劑檢測(cè)為陽(yáng)性，而新型一步法試劑檢測(cè)為陰性。在兩個(gè)試劑盒的靶基因擴(kuò)增區(qū)域外圍序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)，對(duì)這4例樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序復(fù)核，結(jié)果：3例新型試劑檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本測(cè)序結(jié)果均包含UU-DNA序列，可能其靈敏度較之煮沸法試劑更高或抗干擾能力更強(qiáng)；而煮沸法試劑檢測(cè)為陽(yáng)性的1例樣本無(wú)PCR擴(kuò)增片段，懷疑為交叉污染所致。測(cè)序復(fù)核后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表4。

應(yīng)用Kappa評(píng)價(jià)方法對(duì)新型試劑和對(duì)照及復(fù)核檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行診斷一致性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。對(duì)Kappa值的參考評(píng)價(jià)原則如下：0.75＜κ≤1時(shí)，診斷一致性好；0.4＜κ≤0.75時(shí)，診斷一致性一般；0≤κ≤0.4時(shí)，診斷一致性差。經(jīng)SPSS15.0軟件Kappa檢驗(yàn)的輸出結(jié)果，見(jiàn)表5。

由以上輸出結(jié)果可知，Kappa值=1.000，P=0.000。α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，新型一步法試劑與煮沸法試劑及復(fù)核檢測(cè)結(jié)果的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，診斷一致性好。

3討論

目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)解脲脲原體的核酸進(jìn)行提取，具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌、再加裂解液、煮沸、高速離心、取上清為模板；該方法核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污。

本研究對(duì)一種新型的免核酸提取的解脲脲原體熒光定量PCR檢測(cè)方法(一步法)與常規(guī)的煮沸法進(jìn)行對(duì)比研究。整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程均在嚴(yán)格控制下進(jìn)行，由經(jīng)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的測(cè)試人員進(jìn)行檢測(cè)分析。用一步法檢測(cè)，每個(gè)病例只需取少量生理鹽水洗脫樣本，處理簡(jiǎn)單，無(wú)需加熱、轉(zhuǎn)移上清等操作，可大大減少污染的發(fā)生，擴(kuò)增和熒光檢測(cè)均由儀器自動(dòng)進(jìn)行，通過(guò)查看樣本的Ct值判斷陰陽(yáng)性。

本次研究共檢測(cè)樣本176例，根據(jù)煮沸法試劑檢測(cè)結(jié)果分為兩組：其中陽(yáng)性組100例，陰性組76例。新型解脲脲原體核酸檢測(cè)試劑與煮沸法試劑的陽(yáng)性一致性百分比為99.00%，陰性一致性百分比為96.05%，總一致性百分比為97.73%；對(duì)4例不符樣本的復(fù)核結(jié)果表明：4例樣本的測(cè)序結(jié)果均與新型試劑相符。對(duì)復(fù)核后的結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)一致性分析：結(jié)果Kappa值=1.000，表明新型試劑與煮沸法試劑及復(fù)核檢測(cè)的結(jié)果具有很好的一致性。在與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比中，兩種試劑均表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確性。

研究中發(fā)現(xiàn)：一步法的樣本處理和檢驗(yàn)過(guò)程在一個(gè)PCR反應(yīng)管中即可完成，樣本中的核酸在核酸釋放劑的作用下全部釋放并參與到PCR反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)無(wú)需離心、振蕩、更換離心管等一系列繁瑣操作，既簡(jiǎn)化了操作步驟，又節(jié)省了耗材成本，而且無(wú)需加熱、開(kāi)/關(guān)管蓋、移液等可能導(dǎo)致核酸丟失與污染的操作，抗污染能力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性大大提高，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較低。一步法節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，減少污染環(huán)節(jié)，有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控假陰性，結(jié)果準(zhǔn)確，保證臨床醫(yī)生及患者及早得到診斷結(jié)果，避免等待試驗(yàn)結(jié)果的焦慮，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹玉璞，葉元康.支原體與支原體病[M].北京人民衛(wèi)生出版社，2000.

[2]汪寧，賀曉新，等.解脲脲原體分子流行病學(xué)研究[J].中國(guó)性病艾滋病防治，1999，5(4).

[3]任秀柳，鞠曉紅.解脲脲原體檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(3):174-176.

編輯/肖慧