摘要：駱駝體內(nèi)存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體，克隆其可變區(qū)得到的單域抗體是最小的功能性抗原結(jié)合片段，相對分子質(zhì)量為15kD，稱為納米抗體。納米抗體具有容易表達(dá)、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好等優(yōu)點(diǎn)。這種小型抗體在基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)和疾病診斷與治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。本文主要針對納米抗體的性質(zhì)與應(yīng)用進(jìn)行闡述。

關(guān)鍵詞：重鏈抗體；納米抗體；疾病診斷；疾病治療

Properties and application of single domain antibody fragments

GU Kai1，ZHANG Juan1，ZHANG Cheng-hai2，WANG Min1

（1 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China；2.Shanghai CP Guojian，Shanghai 201203，China）

Abstract：Heavy-chain antibody （HCAb） lacking light chain exists naturally in camel. The variable domain of HCAb， the smallest functional antigen-binding fragment is referred to nanobody， which molecular weight is 15kD. They are well expressed and have a high stability and solubility. As a new type antibody in basic research， drug development and disease diagnosis ， nanobody has a broad application prospects. This mini-review offers an overview of its properties and therapeutic.

Key words：Heavy-chain antibody ；Nanobody ；Diagnose ；Therapy

由于在疾病診斷與治療方面的廣泛應(yīng)用，近20年來重組抗體技術(shù)得到迅速的發(fā)展。常規(guī)抗體是由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈組成（圖1a）。通過分子生物學(xué)的技術(shù)和手段，將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接組成各種小分子抗體[1]如ScFv、Diabody（圖1a），不僅保留了完整的抗原結(jié)合部位，而且具有較好的親和力。但是，這些小分子抗體特別是多價形式的小分子抗體的表達(dá)很復(fù)雜。

駱駝體內(nèi)存在的缺失輕鏈的抗體，只含有重鏈，因此又叫做重鏈抗體（圖1b）。其N端結(jié)構(gòu)域（VHH或者納米抗體）能直接識別結(jié)合特異性抗原。VHH是可結(jié)合抗原的最小功能單位，其相對分子質(zhì)量僅為傳統(tǒng)抗體的1/10左右，大小為15kD，直徑2.2nm，高度4.8nm，又被稱作納米抗體。目前，通過噬菌體，酵母和核糖體展示技術(shù)，從免疫，非免疫和半合成納米抗體庫[2-4]中篩選抗原特異性納米抗體的方法已經(jīng)建立。

圖1 抗體的結(jié)構(gòu)示意圖

1納米抗體的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

1.1納米抗體的結(jié)構(gòu) 納米抗體只有一個結(jié)構(gòu)域，沒有Fc段，從而避免了Fc段引起的補(bǔ)體反應(yīng)。與常規(guī)抗體的可變區(qū)相似，VHH包含4個框架區(qū)形成基本骨架，3個互補(bǔ)決定區(qū)是抗原結(jié)合的主要部位。與常規(guī)VH相比，VHH框架區(qū)序列的同源性高達(dá)80%[5]。

通過序列分析和結(jié)構(gòu)解析，揭示了VHH具有一些獨(dú)特的特征。VHH中位于FR2的4個氨基酸[6]（F37、E44、R45、G47）與VH中相同位置的氨基酸不一樣。這幾個在VH中是高度保守的疏水性氨基酸，而在VHH中是親水性氨基酸，增加了VHH的水溶性。與常規(guī)抗體的VH相比，VHH的CDR1可變性更高，CDR3區(qū)更長，形成一個突出的環(huán)，較長的CDR3環(huán)與CDR1或FR2形成一個二硫鍵來穩(wěn)定構(gòu)象[7]。由于VHH只有一個結(jié)構(gòu)域，比常規(guī)抗體小很多，所以在很多方面有廣泛應(yīng)用。

1.2熱穩(wěn)定性 1.3特異性 納米抗體除了可以識別一些常規(guī)的表位外，由于其分子量很小，CDR3區(qū)較長，形成的環(huán)向外延伸，還可以識別常規(guī)抗體無法識別的抗原表位，例如酶的活性位點(diǎn)[10]和一些保守的凹陷的表位[11]。然而，一些半抗原和小分子多肽，通常結(jié)合在VH-VL的縫隙中，很難和VHH結(jié)合。

1.4組織滲透性 納米抗體的分子量很小，很容易從腎小球濾過，導(dǎo)致VHH很快從血漿中清除，使VHH的半衰期很短。另外，VHH有很高的組織滲透作用，VHH很容易偶聯(lián)一些毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，Cortez-Retamozo等[12]利用納米抗體偶聯(lián)毒素物質(zhì)作用于腫瘤細(xì)胞，其穿透性好，特異的作用于腫瘤細(xì)胞，不會引起其它組織損傷。

1.5表達(dá)性 VHH通常在原核系統(tǒng)中表達(dá)，氨基酸的差異對表達(dá)量有很大的影響。研究發(fā)現(xiàn)有幾種形式的序列與表達(dá)量密切相關(guān)。①含有N端糖基化位點(diǎn)的序列，在酵母中的表達(dá)量顯著提高[13]。②與常規(guī)VH相似的VHH，在酵母中的表達(dá)量會下降。③C端未形成二硫鍵的半胱氨酸會降低VHH表達(dá)量[14]。④VHH中一些位于FR2區(qū)域的一些親水性氨基酸能夠顯著增加其在E.coli中的表達(dá)量。此外，一些多聚形式的的VHH表達(dá)量和單體的表達(dá)量相比明顯下降[15]。

2納米抗體的應(yīng)用

目前，對納米抗體的應(yīng)用主要依靠其結(jié)構(gòu)和功能特異性，由于其高的穩(wěn)定性和親和力使得其在許多方面具有廣泛的應(yīng)用。本文主要針對納米抗體在疾病的診斷和治療方面的應(yīng)用進(jìn)行說明。表1[16]顯示了一些納米抗體在相關(guān)疾病治療方面的應(yīng)用。

2.1構(gòu)建多價和多特異性抗體 VHH分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，常用于構(gòu)建多種不同形式的抗體。這些不同形式的抗體在診斷和治療疾病方面具有許多常規(guī)抗體沒有的優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合同一個抗原上的鄰近的多個表位，從而提高對該抗原的親和力；可以偶聯(lián)毒性物質(zhì)，如對細(xì)胞有毒藥物、放射性物質(zhì)等。

2.2作為細(xì)胞內(nèi)抗體 抗體作用于細(xì)胞內(nèi)的單位而起作用，對抗體的穩(wěn)定性提出了更高的要求。由于細(xì)胞內(nèi)是還原性環(huán)境，不利于二硫鍵的形成，所以需要二硫鍵穩(wěn)定的常規(guī)抗體在在細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定存在而沒有功能。納米抗體的高穩(wěn)定性，可溶性以及高表達(dá)性使其非常適合用作細(xì)胞內(nèi)抗體。Gueorguieva等[17]利用噬菌體展示技術(shù)從駝源的納米抗體庫中篩選得到特異性結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白Bax的抗體，此抗體能夠在胞漿中穩(wěn)定的存在，與Bax結(jié)合，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可用于神經(jīng)退行性疾病的治療。

2.3用作腫瘤的診斷和治療 抗腫瘤研究存在兩大難題：①早期診斷、②靶向治療。此二者不僅要求藥物在體內(nèi)迅速到達(dá)疾病部位，而且要求對正常組織損傷降到最低。目前已有多種抗體藥物可供治療腫瘤。但是因為這些抗體屬于大型蛋白質(zhì)，難以穿透腫瘤細(xì)胞；并且他們的復(fù)雜結(jié)構(gòu)使得大量生產(chǎn)非常困難且昂貴，因此在治療癌癥方面仍有改善空間。納米抗體遠(yuǎn)小于常規(guī)抗體，且保有對腫瘤具專一性的特性；其穩(wěn)定，分子量小，屬水溶性蛋白質(zhì)，使生產(chǎn)更容易且便宜。因此，在腫瘤的診斷與治療方面比其他抗體更具優(yōu)勢。研究表明[18]一種與表皮生長因子競爭的納米抗體，與表皮生長因子受體結(jié)合，以阻礙表皮生長因子與其特異性受體結(jié)合，從而阻斷其信號通路，抑制腫瘤新生血管的形成。

2.4用于神經(jīng)性疾病的治療 藥物透過血腦屏障準(zhǔn)確到達(dá)疾病發(fā)生部位，是神經(jīng)性疾病治療面臨的一大挑戰(zhàn)。利用納米抗體可有效的解決這一問題，將神經(jīng)性藥物連接到特異的納米抗體，該抗體能將藥物運(yùn)輸?shù)酱竽X的特定部位，使藥物發(fā)揮療效。納米抗體分子量小，穩(wěn)定性高，組織滲透性強(qiáng)，耐高溫、pH、鹽等特性，使其在這方面的應(yīng)用有很大的優(yōu)越性。Muruganandam等[19]利用噬菌體展示技術(shù)成功篩選出兩個特異性納米抗體FC5和FC44，體外體內(nèi)試驗證明這兩種抗體能有效透過血腦屏障到達(dá)靶部位，為納米抗體應(yīng)用于神經(jīng)性疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。

最后，納米抗體作為一種新型抗體，具有完整的抗原結(jié)合能力。其分子量小、特異性強(qiáng)、組織滲透性高以及易于表達(dá)等優(yōu)越性，使其在抗炎、抗感染及風(fēng)濕性疾病等方面也具有很大的發(fā)展前景。

3結(jié)論

自1993年重鏈抗體發(fā)現(xiàn)以來，納米抗體已經(jīng)取得了快速的發(fā)展。在應(yīng)用方面VHH具有很多常規(guī)抗體沒有的優(yōu)勢。納米抗體作為最小的具有完整功能的抗原結(jié)合片段，具備親和力高、穩(wěn)定性好、相對分子質(zhì)量小、組織穿透力強(qiáng)、免疫原性低、易于操作等常規(guī)抗體所不具備的優(yōu)越性，在疾病的治療和診斷以及食品檢驗等領(lǐng)域等都有著廣闊的應(yīng)用空間[20]。然而，將納米抗體應(yīng)用于臨床仍有許多問題需要解決，免疫原性是大分子藥物用于臨床治療首要需要解決的問題，而且多價多特異性抗體及融合抗體分子量更大，多劑量重復(fù)使用將會產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫原性，對治療效果將會產(chǎn)生很大的影響。盡管如此，對于納米抗體作為小分子治療抗體的研究仍會不斷持續(xù)，相信在不久的將來隨著臨床應(yīng)用中各種問題的解決，納米抗體在疾病的診斷和治療中將發(fā)揮巨大功效。

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編輯/申磊