摘要：目的 采用不同劑量的X線照射急性白血病細胞系HL-60，探究電離輻射后Rac1蛋白在HL-60細胞中表達的變化及其對輻射誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。方法 藻紅B染色觀察細胞的凋亡，Western blot分析 Rac1蛋白的表達，免疫熒光檢測Rac1蛋白在細胞內(nèi)的分布。結(jié)果 2Gy、6Gy、8Gy的X射線照射HL-60細胞，24h后的細胞凋亡率分別為11.5%、18.0%、 30.1%。不同劑量的X線照射HL-60細胞24h后，總的Rac1蛋白表達未發(fā)生明顯變化，而在細胞內(nèi)的分布發(fā)生改變，激活的Rac1蛋白在細胞膜的表達增加，并且核內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了少量的Rac1蛋白。結(jié)論 轉(zhuǎn)移到細胞膜及細胞核內(nèi)激活的Rac1蛋白參與了輻射誘導(dǎo)細胞的凋亡的過程。

關(guān)鍵詞：電離輻射；Rac1；凋亡率

Rac1是Rho蛋白家族中的重要一員，也是細胞內(nèi)重要的信號分子，它在腫瘤的形成和發(fā)展中具有一定的作用[1]。Rac1蛋白在胃癌、腦膠質(zhì)瘤、胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[2]。并與腫瘤的分化、預(yù)后密切相關(guān)，它主要通過影響細胞的凋亡、增殖，細胞的遷移，細胞周期進展，血管形成等多方面來對腫瘤起作用[2～4]。本實驗主要研究X線照射后Rac1蛋白在HL-60細胞中的表達變化，為輻射誘導(dǎo)細胞凋亡的機制提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 急性白血病HL-60細胞株購自上海中科院細胞研究所，RPMI一1640培養(yǎng)基為HyClone產(chǎn)品，新生牛血清為Gibco產(chǎn)品，碘化丙啶（PI）購自美國Sigma公司，藻紅B染色購于上海四季青公司，兔抗Rac1（c-14）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、兔源性抗人Actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，直線加速器購于西門子公司（劑量率200cGy/min）。

1.2細胞凋亡分析 HL-60細胞用含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，置于5% CO2 培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞，用X線分別給以0 、 2、 6、8 Gy照射對數(shù)生長期細胞，照后24h用染料藻紅B對細胞染色，活細胞不能被染色，死細胞的核被染成紅色，根據(jù)被染色細胞占總觀察細胞的百分率計算細胞的凋亡率，每次處理觀察200個細胞[5]。

1.3Western blot檢測Rac1蛋白的表達

1.4免疫熒光染色檢測Rac1蛋白在細胞內(nèi)的表達

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。劑量資料用均數(shù)±標(biāo)準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同劑量X射線照射24h后HL-60細胞的凋亡

注：表中±后為單次測量標(biāo)準羞， *表示差異顯著 P<0.05

圖1 Western blot分析X線照射HL-60細胞24h后Rac1蛋白變化

2.3 X線照射后HL-60細胞中Rac1蛋白的分布 由下圖可知Rac1在未照射的HL-60細胞中，主要分布在細胞質(zhì)，少量在細胞膜上表達，而照射后24h時，Rac1不僅存在于胞質(zhì)和膜上，在核內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了少量的Rac1蛋白，由此可推測轉(zhuǎn)移至細胞膜、細胞核內(nèi)Rac1參與了輻射誘導(dǎo)細胞的凋亡的過程。見圖2。

圖2 免疫熒光染色分析Rac1在細胞內(nèi)的分布

3討論

Rac1全稱為Ras相關(guān)的C3肉毒底物1，是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子開關(guān)，在接受胞外刺激信號后，可從聯(lián)結(jié)GDP的失活狀態(tài)轉(zhuǎn)為聯(lián)結(jié)GTP的激活狀態(tài)，Rac1的生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于此兩種活性形式之間的轉(zhuǎn)換。激活的Rac1通過活化PKA16參與細胞骨架的形成，并可以激活Cofilin參與肌動蛋白形成，從而影響細胞運動、遷移。有研究發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在白血病、宮頸癌、結(jié)直腸癌 、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達，并促進腫瘤細胞的增值、侵襲和轉(zhuǎn)移[6～8]。Rac1蛋白有可能作為反映腫瘤生物學(xué)行為的一種新型標(biāo)志物。也有研究表明，Rac1可以通過MAP激酶途徑、

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編輯/許言