李衛(wèi)玲，張婭玲，李彥青，張麗娟，夏海濱

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安 710119）

顆粒蛋白前體（Progranulin，PGRN）是一種具有多種生物學(xué)功能的生長(zhǎng)因子，除參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育［1］、組織損傷修復(fù)和抗炎癥等生理過(guò)程外［2］，還與腫瘤及糖尿病的發(fā)生有著密切的關(guān)系［3－4］.近年來(lái)研究表明，PGRN基因突變引起的單倍劑量不足（表達(dá)或分泌降低）是導(dǎo)致具有泛素陽(yáng)性包涵體特征的額顳葉變性發(fā)生的主要因素之一［5］.PGRN在結(jié)構(gòu)上包含七個(gè)半結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域，以P—G—F—B—A—C—D—E的順序排列，其中P為半個(gè)結(jié)構(gòu)域.每個(gè)結(jié)構(gòu)域都是由四個(gè)β－發(fā)夾結(jié)構(gòu)以旋轉(zhuǎn)的梯狀結(jié)構(gòu)堆積而成，含有12個(gè)半胱氨酸并形成六對(duì)二硫鍵，這些結(jié)構(gòu)域之間以短的多肽連接，彈性蛋白酶在連接處可將顆粒蛋白前體水解為大小不等的片段，這些片段很可能具有不同的生物學(xué)功能［6］.目前對(duì)PGRN研究大多都集中于其生物學(xué)功能，對(duì)PGRN的各結(jié)構(gòu)域功能及其分子機(jī)制研究較少.

Sortilin分子是調(diào)節(jié)細(xì)胞外PGRN水平的主要決定因素.Sortilin N－末端β螺旋結(jié)構(gòu)域可與PGRN C－末端Grn E結(jié)合，介導(dǎo)PGRN的內(nèi)化及運(yùn)輸［7］.TDP-43可通過(guò)上調(diào)Sortilin的表達(dá)來(lái)促進(jìn)PGRN吸收，從而減少細(xì)胞外PGRN水平［8］.PGRN能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活［9］，有研究表明PGRN的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子功能是通過(guò) Grn E 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的［10］，但PGRN在發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子功能方面并不依賴(lài)膜受體Sortilin［11］.

單克隆抗體在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面有重要的作用.目前還沒(méi)有針對(duì)人Grn E單抗的報(bào)道，為此，本文將原核表達(dá)GST-Grn E融合蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過(guò)融合及初步篩選，成功獲得5株針對(duì)Grn E的單克隆抗體細(xì)胞株，并對(duì)此進(jìn)行初步鑒定.針對(duì)人Grn E單克隆抗體的成功制備為探索PGRN及Grn E的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制奠定重要基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、菌株及載體

SP2/0和 HEK293 購(gòu)自美國(guó) ATCC，E.coli DH5α及BL21（DE3）菌株 均由本實(shí)驗(yàn)室保存.pGEM-T easy克隆載體購(gòu)自Promega公司；pRSET-B原核表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司；pGEX-4T-3原核表達(dá)載體購(gòu)自Amersham公司；pOTB7/hPGRN質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)ATCC公司.4～6周齡Balb/c雌性小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué).

1.2 主要試劑

改良型RPMI-1640干粉購(gòu)自Hyclone公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；8AG、PEG3350、IL-6、石 蠟 油 購(gòu) 自 Sigma；100×HT、50×HAT購(gòu)自 Gibco；BSA 購(gòu)自 Hyclone；ABTS購(gòu)自Gibco；Ni-NTA柱購(gòu)自Novagen公司；限制性?xún)?nèi)切酶Prime STAR，dNTP mix，Solution I購(gòu)自日本TaKaRa公司；小提中量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；DNA Marker購(gòu)自 Hybigen公司；Anti-His antibody購(gòu)自天根生物技術(shù)公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自中杉金橋公司；ECL免疫印跡底物購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；DAPI購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；小鼠單克隆抗體亞型鑒定Elisa kit購(gòu)自Sigma公司.

1.3 Grn E蛋白的表達(dá)

1.3.1 人Grn E片段基因的克隆 Grn E位于人PGRN基因的1555～1782bp，共228bp.以實(shí)驗(yàn)室保存的hPGRN基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)Grn E引物，5’-ClaI for:ATCGATgtggagtgtggggaaggaca，3’-SpeI no stop back:ACTAGTcagcagctgtctcaaggctg.所用引物由北京華大基因公司合成.

PCR產(chǎn)物連接pGEMT-easy載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，小提質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切初步鑒定為陽(yáng)性克隆后送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，正確的克隆命名為pGEM-T easy/Grn E，并將之用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3.2 人Grn E原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)純化pGEM-T easy/Grn E由ClaI和SpeI雙切后，回收片段.分別連入6His-tag原核表達(dá)載體pRSET-B和 GST-tag原核表達(dá)載體pGEX-4T-3中，經(jīng) KpnI酶單切鑒定切不動(dòng)的為疑似陽(yáng)性質(zhì)粒.然后再由ClaI和SpeI雙酶切進(jìn)一步驗(yàn)證，切出300bp條帶的陽(yáng)性克隆分別命名為pRSET-B/Grn E和pGEX-4T-3/Grn E，并將之用于后續(xù)原核表達(dá).

質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)終濃度1mmol/L IPTG誘導(dǎo)（37℃，225r/min，4h）后，收集菌體，低溫超聲裂解，以10%SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá).當(dāng)所構(gòu)建的His-Grn E和GSTGrn E蛋白表達(dá)良好且分子量與預(yù)期大小一致時(shí)，即進(jìn)行大量表達(dá)純化.分別挑取表達(dá)量較好的pRSET-B/Grn E 克隆4和pGEX-4T-3/Grn E 克隆2菌液劃板后挑取單克隆于200mL培養(yǎng)基，至OD600nm為0.6，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以8mmol/L尿素變性方法純化過(guò)柱，分別以20mmol/L、40 mmol/L、60mmol/L和80mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，最后以250mmol/L咪唑洗脫目的蛋白.

1.4 單克隆抗體的制備

1.4.1 免疫動(dòng)物 免疫4只6周齡Balb/c雌性小鼠，GST-Grn E原核蛋白免疫量為40μg/只.將200 μg免疫原稀釋于2mL經(jīng)生理鹽水中，然后加等體積褔氏完全佐劑充分研磨，皮下多點(diǎn)注射.間隔3周，第二次免疫生理鹽水稀釋后加褔氏不完全佐劑研磨.間隔3周后，第三次免疫生理鹽水稀釋至80 μg/mL腹腔注射每只0.5mL，2周后斷尾取血測(cè)定免疫效價(jià).選取效價(jià)好的小鼠加強(qiáng)免疫，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.4.2 骨髓瘤細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備 復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，8AG終濃度20μg/mL篩選穩(wěn)定后擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞總數(shù)約為5×107.鋪板2只正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞.

麻醉脫頸處死4號(hào)免疫鼠后，75%酒精消毒5 min，制備脾細(xì)胞總數(shù)約為2×108，調(diào)整骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的比例為1∶5.取37℃預(yù)熱融合劑1 mL，30s內(nèi)加完，室溫靜置90s.加終止液無(wú)血清1640培養(yǎng)基，9min內(nèi)加完25mL.800r/min，4 ℃離心6min.重懸至42mL鋪于飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板.

1.4.3 雜交瘤細(xì)胞篩選和克隆培養(yǎng) 融合24h后開(kāi)始HAT/HT選擇性培養(yǎng)液篩選.7～10d后當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至合適大小時(shí)補(bǔ)充換液，采用Elisa方法檢測(cè)細(xì)胞上清中的抗體，將陽(yáng)性培養(yǎng)孔中的雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)限稀釋法，以每孔分別含0.5、1和2個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中.經(jīng)過(guò)3～4次克隆化檢測(cè)為全陽(yáng)性后，選擇抗體效價(jià)高、呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞孔，進(jìn)行轉(zhuǎn)孔擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存.

1.4.4 抗體腹水的制備 從篩選得到的5株針對(duì)Grn E陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株中選取效價(jià)較好的3株制備腹水.選取6周齡Balb/c雌性小鼠12只，腹腔注射石蠟油0.8mL/只.7～14d后，1×PBS重懸的雜交瘤細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL，腹腔注射0.5mL/只.1周左右收獲含有抗體的腹水，分裝凍存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.5 針對(duì)Grn E單克隆抗體的鑒定

1.5.1 Western blot 變性后的樣品經(jīng)10%SDSPAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗室溫孵育1h，再經(jīng)山羊抗小鼠IgG HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）室溫孵育1h，ECL發(fā)光，暗室顯影.

1.5.2 免疫熒光染色 細(xì)胞經(jīng)4%甲醇室溫固定15min，1×PBS洗滌后再由0.5%Triton X-100通透20min，一抗室溫孵育2h，再經(jīng)山羊抗小鼠IgG TRITC標(biāo)記的二抗（1∶100）室溫1h，DAPI（1∶3 000）染色10min，熒光倒置顯微鏡下觀察照相.

1.5.3 免疫沉淀 將攜帶PGRN的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)于一個(gè)60mm培養(yǎng)皿的HEK293細(xì)胞中，48h后制備獲得500μL細(xì)胞裂解液，其中取50 μL細(xì)胞裂解液加入等體積的2×SDS，變性后取20 μL作為input用于western blot檢測(cè)；分別取ProteinA/G珠子20μL和抗體2μL于500μL 3%BSA中，4℃，10r/min封閉結(jié)合1h，經(jīng)完全洗滌后，將剩余的450μL細(xì)胞裂解液全部加入上述珠子繼續(xù)結(jié)合1h，珠子經(jīng)1×PBS洗滌后，加入等體積約20μL的2×SDS，變性后全部上樣用于western blot檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 His-Grn E及GST-Grn E原核表達(dá)表達(dá)和純化

將pRSET-B/Grn E酶切鑒定正確的克隆電轉(zhuǎn)至BLD21（DE3）菌株，隨機(jī)挑取4個(gè)克隆，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為17kD處與未誘導(dǎo)相比有較強(qiáng)特異性條帶（圖1a）.細(xì)菌裂解液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，采用anti-His抗體經(jīng)western blot檢測(cè)，17kD處有His-Grn E目的條帶 （圖1b），表明所誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白正確.Nano drop OD280nm吸光值測(cè)濃度分別為1.06mg/mL.

圖1 pRSET-B/Grn E的原核表達(dá)純化Fig.1 The prokaryotic expression and purification of pRSET-B/Grn E

將pGEX-4T-3/Grn E電轉(zhuǎn)至BLD21（DE3）菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在相對(duì)分子質(zhì)量為34kD處，細(xì)菌裂解液中有1條特異性條帶，而未誘導(dǎo)處相應(yīng)蛋白基本無(wú)表達(dá)（圖2a）.細(xì)菌裂解液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，western blot檢測(cè)，34kD處有 GST-Grn E目的條帶（圖2b），測(cè)定濃度為0.43mg/mL.

圖2 pGEX-4T-3/Grn E重組蛋白原核表達(dá)與純化Fig.2 The expression and purification of pGEX-4T-3/Grn E

2.2Grn E單克隆抗體的制備

免疫小鼠斷尾取血，經(jīng)Elisa檢測(cè)選取效價(jià)達(dá)到1∶128 000的4號(hào)免疫鼠，取脾臟經(jīng)雜交瘤融合技術(shù)獲取雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)3次有限稀釋法克隆化和Elisa檢測(cè)均全陽(yáng)性的有5株，分別是1D5，1G5，2E1，3F7和4D4.選取其中效價(jià)較高的3株1D5、2E1和3F7擴(kuò)大培養(yǎng)制備腹水，以備后期檢測(cè)用.通過(guò)使用Sigma小鼠單克隆抗體亞型鑒定Elisa kit，測(cè)定1D5和3F7均為IgG1型，2E1為IgG2a（圖3）.

圖3 雜交瘤分泌的抗體亞型測(cè)定Fig.3 The detection of the subtype of antibody from hybridoma cell lines

2.3 人Grn E單克隆抗的鑒定

2.3.1 Western blot鑒定 分別采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染將攜帶PGRN和Grn E的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，72h裂解細(xì)胞收取蛋白，然后通過(guò)western blot鑒定所制備抗體.結(jié)果顯示所制備的針對(duì)人Grn E的3株抗體（1D5、2E1及3F7）在稀釋1∶1 000時(shí)能檢測(cè)到與目的片段大小一致的特異條帶（見(jiàn)圖4）.

圖4 針對(duì)Grn E單克隆抗體的western blot鑒定Fig.4 The diagnosis of anti-Grn E monoclonal antibody by western blot

2.3.2 免疫熒光染色鑒定 為了檢測(cè)所制備的單克隆抗體是否可以用于免疫熒光染色，將攜帶外源人PGRN和Grn E基因的真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，24h后4%甲醛固定細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光染色檢測(cè)所制備的抗體.放大倍數(shù)為目鏡是10X，物鏡20X.陰性對(duì)照為anti-GST tag.結(jié)果表明，3株抗體可以檢測(cè)出PGRN和Grn E的表達(dá)（見(jiàn)圖5）.

2.4 Grn E抗體用于免疫沉淀的鑒定

抗體在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)過(guò)程具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為了驗(yàn)證所制備的針對(duì)人Grn E單克隆是否可以用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，我們選取腹水效價(jià)較好的1D5和3F7兩株單克隆抗體先與Protein A/G珠子進(jìn)行結(jié)合，經(jīng)過(guò)充分洗滌后再與轉(zhuǎn)染有外源PGRN基因的細(xì)胞裂解液孵育，最后用于免疫印跡的抗體選用實(shí)驗(yàn)室以往制備的針對(duì)PGRN中Grn A結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體［12］.免疫印跡所獲得分子量與PGRN分子量相一致，該結(jié)果表明，兩株針對(duì)人Grn E抗體可用均于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖6）.

圖5 針對(duì)人Grn E單克隆抗體的細(xì)胞免疫熒光染色鑒定Fig.5 Immunofluorescence staining of monoclonal antibodies against Grn E in HEK293

圖6 Grn E單克隆抗體用于免疫沉淀淀檢測(cè)Fig.6 The detection of anti-Grn E by immunoprecipitation assay

3 討論

PGRN及其水解產(chǎn)生的Grn多肽均具有一定的生物學(xué)功能，在它們的功能研究中，抗體是一種有利的、必不可少的工具.針對(duì)PGRN的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，制備能夠用于識(shí)別不同結(jié)構(gòu)域的抗體，對(duì)于PGRN的功能研究和臨床應(yīng)用有重要意義.

本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)通過(guò)純化的真核表達(dá)的PGRN－免疫Balb/c小鼠，僅獲得針對(duì)Grn A、Grn B和Grn C三個(gè)結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體［12］.鑒于Grn E結(jié)構(gòu)域的重要性，為了獲得針對(duì)人Grn E的單克隆抗體，我們通過(guò)采用原核載體單獨(dú)表達(dá)Grn E結(jié)構(gòu)域，并將之用于制備針對(duì)該結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體.經(jīng)過(guò)Elisa初步篩選獲得5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，其中1G5和4D4效價(jià)相對(duì)較低，因此選取另外3株:1D5、2E1和3F7制備腹水和測(cè)定亞型，三株抗體的亞型均為IgG型.在后期western blot和免疫熒光染色鑒定中，1D5和3F7顯示出良好的特異性及敏感性，其中2E1效果相對(duì)較差，可能與腹水質(zhì)量不高有關(guān)；或者與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)染色體丟失而喪失抗體分泌能力有關(guān).因此，后續(xù)可通過(guò)復(fù)蘇該細(xì)胞株再次克隆化并制備腹水進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè).此外，經(jīng)免疫沉淀結(jié)果驗(yàn)證1D5和3F7可用于后續(xù)與PGRN相互作用蛋白的實(shí)驗(yàn)研究.

4 結(jié)論

本文制備并獲得3株針對(duì)人Grn E的單克隆抗體.經(jīng)ELISA測(cè)定證實(shí)1D5和3F7亞型均為IgG1型，2E1為IgG2a；所制備的針對(duì)Grn E的單克隆抗體均可以通過(guò)western blot和免疫熒光染色；通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，所制備的人Grn E抗體可用于后續(xù)與PGRN相互作用蛋白的研究.針對(duì)人Grn E單抗的成功制備，為PGRN和Grn E功能研究及其分子機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ).

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