侯 巍，鄧永強(qiáng)，陽愛國，郭 莉，文 豪，陳 冬

（四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

狂犬病是由彈狀病毒科的狂犬病毒引起的一種人畜共患急性傳染病。該病可以引起人和多種動物致死性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[1-2]。在我國，狂犬病的主要宿主動物與傳染源是犬。為了解四川省犬只免疫接種情況和抗體產(chǎn)生情況，有效制定狂犬病防控措施，筆者一行對四川省14個市州的258條犬進(jìn)行了狂犬病免疫抗體監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 對照血清。標(biāo)準(zhǔn)狂犬病陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)狂犬病陰性血清，由ELISA試劑盒廠家提供。

1.1.2 待檢血清。來自四川省南充市、綿陽市、廣元市等14個市州的258頭份犬只血樣。

1.1.3 診斷試劑。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自荷蘭EVL公司。ELISA試劑盒包括：96孔包被滅活全病毒酶聯(lián)板、酶標(biāo)條支架、HRPO酶標(biāo)抗體、洗液（200倍濃縮）、ELISA緩沖液、底物緩沖液、終止液、封口膜。

1.1.4 儀器設(shè)備。全自動酶標(biāo)儀（Biorad），美國產(chǎn)；多通道加樣器（EPPENDORF），德國產(chǎn)；單道加樣槍（EPPENDORF），德國產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采血。2013年2～8月采集各市州犬只血清樣本，共采集14個市州（南充、綿陽、廣安、樂山、涼山、巴中、宜賓、雅安、資陽、攀枝花、廣元、瀘州、內(nèi)江、遂寧）的血清樣本258份。

1.2.2 分離血清。將所采集的血樣置37℃恒溫箱中溫浴30min，再經(jīng)2000r/min離心5min，靜置后分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。將酶標(biāo)板內(nèi)的液體清空，清洗4次，除去孔內(nèi)的殘液，取100μL稀釋100倍的樣品加入孔內(nèi)，37℃孵育60min。每板設(shè)兩孔陰性對照，兩孔陽性對照。以1∶200的比例將洗滌液稀釋，然后每孔加入250μL進(jìn)行洗滌，重復(fù)4次（最后一次傾倒后要拍干）。再在每孔中加入100μL特異性酶標(biāo)結(jié)合物，封板，37℃孵育60min。

以1∶200的比例將洗滌液稀釋，每孔加入250μL進(jìn)行洗滌，重復(fù)4次（最后一次傾倒后要拍干）。然后在每孔加入100μL底物（緩沖液A和緩沖液B等體積混合），室溫（21℃）下孵育15min。最后在每孔加入終止液50μL，10min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測其OD450nm值。

2 結(jié)果判定

2.1 試驗(yàn)有效性 陽性對照OD450nm≥1.000；陰性對照 OD450nm<0.350，終點(diǎn)滴度≤50。

2.2 結(jié)果判定方法 如果樣品的OD值比陰性對照的OD值大0.200以上，則樣品為陽性。

3 試驗(yàn)結(jié)果

14個市州的犬只抗體總陽性率為20.9%，各市州的陽性率在25%～50%之間，其中有3個市州的血清陽性檢測率為0。

3.1 抗體的地域分布 將采自四川省14個市州的犬只血清樣品共258份統(tǒng)一編號，統(tǒng)計后進(jìn)行抗體檢測。結(jié)果：血清抗體陽性率分別為24%、23%、50%、59%、0、5%、50%、30%、10%、40%、0、0、30%、15%。

3.2 群體的抗體陽性率 本次試驗(yàn)共采集四川省犬只血液樣品258頭份，抗體總陽性率為20.9%。

4 討論

4.1 采樣及樣品處理的科學(xué)性 本試驗(yàn)所采集的258份犬只血液樣品來自四川省14個市州，充分考慮到了血液樣品的地域分布和樣品的代表性。另外，由于不同犬只產(chǎn)生抗體的時間會有所不同，故所有的血液樣本采集時間從2月到8月不等，期間跨越7個月時間（犬只免疫一般是在春季），并作了詳細(xì)的記錄和編號。

4.2 抗體陽性率 本試驗(yàn)共采集犬只血清樣品共258份，經(jīng)檢測，抗體總陽性率為20.9%。由此判斷四川省犬只的狂犬病免疫率低，需重新加強(qiáng)免疫。

4.3 診斷方法的選擇 對犬只狂犬病的診斷，不同的情況選用不同的診斷方法。未用疫苗免疫過的發(fā)病犬，只用免疫熒光試驗(yàn)或內(nèi)基氏小體檢查，血清為陽性即可確診；對于免疫過的犬只抗體檢測，需采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來確診。

4.4 免疫率低的原因分析

4.4.1 疫苗經(jīng)費(fèi)缺乏，犬只免疫工作不到位。未進(jìn)行免疫的犬只，不能刺激犬機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，也就不能產(chǎn)生有效的抗體。四川省是養(yǎng)犬大省，犬只數(shù)量多，約為600多萬條，因此給免疫工作帶來了很大的難度。另外，國家尚未啟動狂犬病專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目，四川省的狂犬病專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)較少，每年只有50萬元購買狂犬病疫苗，不夠1/3的犬只免疫。地方財政好的地方可以自行解決部分疫苗經(jīng)費(fèi)，而地方財政差的市州則沒有多余的經(jīng)費(fèi)購買疫苗，這是免疫率低的重要原因。

4.4.2 對狂犬病免疫監(jiān)測工作的重視不夠。狂犬病的病死率極高，每年狂犬病的病死率居我國死亡病種前列。我國對動物狂犬病防治工作的重視不夠，其主要原因是相關(guān)獸醫(yī)管理部門未清楚地認(rèn)識到動物狂犬病防治是控制人狂犬病發(fā)生的關(guān)鍵和必要前提，更沒有將犬只的狂犬病免疫作為工作重點(diǎn)。目前，國內(nèi)對狂犬病易感動物的免疫預(yù)防與監(jiān)測工作開展不到位，也是狂犬病疫情得不到控制的又一原因。

4.4.3 疫苗質(zhì)量問題。疫苗效價越高，其免疫效果越好，目前市場上已有多家動物狂犬病疫苗，難免因各廠家的生產(chǎn)工藝、所用種毒、細(xì)胞、疫苗保護(hù)劑及凍干條件不同而使疫苗的質(zhì)量出現(xiàn)差異。質(zhì)量較差的疫苗注射到犬體之后，或表現(xiàn)免疫不良，或表現(xiàn)發(fā)病。另外，即使是質(zhì)量較好的疫苗，在貯存、運(yùn)輸、使用過程中若不注意正確的使用方法（特別是稀釋溶解后的疫苗，短時間內(nèi)穩(wěn)定性即可大大降低），也可使疫苗滴度降低，造成免疫失敗。

[1]王功臣，馬世春.獸醫(yī)公共衛(wèi)生[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2011:45-47.

[2]謝世宏，陳科文.狂犬病防制指南[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社，1992.