張瑞英，陳龍聰，張婷婷，熊興良

（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶 400016）

0 引言

近年來，隨著工農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，水環(huán)境中Pb污染日益加劇，由此造成的Pb中毒事件更是層出不窮。Pb是一種穩(wěn)定的不可降解的污染物，可通過皮膚、消化道、呼吸道進(jìn)入人體，積蓄到一定的量就會(huì)導(dǎo)致貧血癥、神經(jīng)機(jī)能失調(diào)、腎損傷和腦損傷等。此外，Pb對(duì)兒童的影響最大，兒童血Pb2+濃度達(dá)到0.483 μmol/L時(shí)，就會(huì)影響其大腦發(fā)育造成智力障礙。因此，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署規(guī)定飲用水中Pb2+的最大含量不得超過72 nmol/L。

傳統(tǒng)的Pb2+檢測(cè)方法，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、陽極溶出伏安法（anodic stripping voltammetry，ASV）、原子吸收光譜法（atomic absorption spectrometry，AAS）等，雖然檢測(cè)靈敏度高，但是存在儀器昂貴、樣品預(yù)處理復(fù)雜、需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)。因此，人們迫切的需要一種快速、準(zhǔn)確、低成本的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)Pb2+檢測(cè)技術(shù)。比色、熒光、電化學(xué)傳感器滿足上述要求，并在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與應(yīng)急處置方面展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。本文綜述了這3種Pb2+生物傳感器的研究現(xiàn)狀，指出其存在的問題，并展望其發(fā)展方向。

1 比色傳感器

比色傳感器是以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測(cè)組分含量的方法。在重金屬離子檢測(cè)中，近年最常用的顯色物質(zhì)為金屬納米顆粒，尤其是Au納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）。AuNPs是尺寸為1～100nm的Au顆粒，由于其具有高摩爾消光系數(shù)、獨(dú)特的局部表面等離子共振特性和易于表面功能化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于比色傳感中［1］。其檢測(cè)原理如圖1:AuNPs表面固定Pb2+識(shí)別分子，由于顆粒為分散狀態(tài)而呈紅色;當(dāng)Pb2+存在時(shí)，Pb2+與識(shí)別分子之間的結(jié)合導(dǎo)致AuNPs聚集，引起AuNPs局部表面等離子共振發(fā)生變化，溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)色或紫色。識(shí)別分子決定了檢測(cè)的特異性。

1.1 以生物分子或有機(jī)小分子作為識(shí)別分子

根據(jù)含有巰基、羧基、氨基的生物分子與Pb2+存在配位絡(luò)合作用，利用Au-S鍵或Au-N鍵固定或吸附在AuNPs表面，制成 Pb2+比色傳感器。如谷胱甘肽（glutathione，GSH）含有2個(gè)羧基和1個(gè)氨基，可以和Pb2+結(jié)合。Chai F等人［2］用 GSH 修飾 AuNPs，加入 Pb2+后，由于 Pb2+和GSH結(jié)合，AuNPs迅速聚集，溶液顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，其檢測(cè)下限為100 nmol/L。木瓜蛋白酶含7個(gè)半胱氨酸殘基，可以和 Hg2+，Pb2+，Cu2+結(jié)合，Guo Y 等人［3］用木瓜蛋白酶修飾的AuNPs設(shè)計(jì)了一種同時(shí)檢測(cè)Hg2+，Pb2+，Cu2+的比色傳感器，該方法對(duì)這3種離子的檢測(cè)下限均達(dá)到500 nmol/L，不過需要指出的是，該方法難于實(shí)現(xiàn)單一離子的檢測(cè)，且靈敏度有待提高。

有機(jī)小分子也常被用作Pb2+的識(shí)別分子，如Yoosaf K等人［4］根據(jù)沒食子酸（gallic acid，GA）的酚羥基可以和Pb2+發(fā)生配位結(jié)合，利用GA修飾的AuNPs檢測(cè)Pb2+。該傳感器用GA做還原劑將氯金酸中的Au3+還原成Au0生成GA修飾的AuNPs，避免了檸檬酸還原法制備AuNPs時(shí)加熱煮沸等耗時(shí)的步驟，該傳感器的檢測(cè)下限為5 nmol/L。此外根據(jù)Pb2+在堿性溶液中易生成Pb（OH）3-，可以與羧基較強(qiáng)的結(jié)合，Guan J等人［5］用檸檬酸修飾的 AuNPs，在pH為11.2時(shí)，對(duì)Pb2+進(jìn)行檢測(cè)。此時(shí)溶液中羥基濃度增加，抑制了其他離子和檸檬酸中羧基的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的特異性檢測(cè)，其檢測(cè)范圍為0.2 ～15 μmol/L。

圖1 AuNPs比色傳感器檢測(cè)Pb2+原理圖Fig 1 Principle diagram of AuNPs colorimetric sensor for detection of Pb2+

1.2 以DNA為識(shí)別分子

以生物分子或有機(jī)小分子作為識(shí)別分子的Pb2+比色傳感器雖然在靈敏度上滿足了實(shí)際應(yīng)用的要求，但大多數(shù)還存在選擇性差的問題。由于DNA具有如高親和力、易于合成、化學(xué)穩(wěn)定性，能快速固定在固體表面等優(yōu)點(diǎn)，近年來提出了以DNA作為識(shí)別分子的Pb2+比色傳感器。如“8-17”DNAzyme（包括酶鏈和基底鏈），Pb2+可以和酶鏈特異性結(jié)合，激活酶鏈的活性，裂解基底鏈（含活性酶鏈的切割位點(diǎn)）。Liu J W等人［6］以“8-17”DNAzyme作為識(shí)別元件、以AuNPs作為傳感元件設(shè)計(jì)了一種Pb2+比色傳感器?！?-17”DNAzyme通過基底鏈兩端和AuNPs表面修飾DNA片段的堿基配對(duì)，使AuNPs聚集;當(dāng)加入Pb2+時(shí)，DNAzyme的基底鏈被裂解，酶鏈釋放，從而導(dǎo)致AuNPs分散，顏色從藍(lán)色變成紅色。該方法檢測(cè)下限為100 nmol/L。利用DNAzyme存在著2個(gè)缺點(diǎn):冗長(zhǎng)的分析時(shí)間和所需系統(tǒng)溫度的改變。此外，莫志宏等人［7］利用Pb2+與富含G的核苷酸序列形成穩(wěn)定的Pb2+-G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，將富含G的核苷酸序列修飾到AuNPs表面，設(shè)計(jì)了一種Pb2+傳感器。當(dāng)加入Pb2+時(shí)，AuNPs表面的核苷酸形成了G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致AuNPs聚集，溶液變色。該方法檢測(cè)下限為20 nmol/L，但是其選擇性不好，易受Hg2+的干擾。

與其他方法相比，比色傳感器的最大優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)結(jié)果只需要裸眼觀察，不需要其他先進(jìn)的配套儀器，操作簡(jiǎn)單，因此，吸引了眾多研究者的目光［8］。

2 熒光傳感器

熒光傳感器是以熒光信號(hào)為檢測(cè)對(duì)象，通過熒光增強(qiáng)、猝滅，或者發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)，進(jìn)行定性或定量分析的方法。用于Pb2+檢測(cè)的多為熒光適配體傳感器，其中適配體是經(jīng)過體外篩選得到的寡核苷酸序列，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行高親和力和高特異性結(jié)合。熒光適配體傳感器通常分為“熒光打開”和“熒光關(guān)閉”2種方式［9］，主要是用熒光基團(tuán)標(biāo)記適配體，基于目標(biāo)分子和適配體作用后產(chǎn)生熒光偏振或熒光強(qiáng)度的改變檢測(cè)目標(biāo)分子，或者將熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別標(biāo)記在適配體上，通過目標(biāo)分子引入體系中引發(fā)熒光信號(hào)改變分析待測(cè)物。

Kim J H等人［10］設(shè)計(jì)了一種基于DNAzyme和 AuNPs的“熒光打開”Pb2+生物傳感器。根據(jù)AuNPs具有抗氧化性、低熒光背景和高猝滅效率等優(yōu)點(diǎn)，該傳感器用AuNPs代替有機(jī)猝滅劑，克服了先前DNAzyme熒光傳感器的不完全熒光猝滅、需要對(duì)DNAzyme和基底進(jìn)行退火處理，并且需要移除不耦合的基底等缺點(diǎn)。如圖2所示，將熒光標(biāo)記的Pb2+特異性結(jié)合物質(zhì)DNAzyme的基底鏈修飾到AuNPs表面，不存在Pb2+時(shí)，熒光供體和AuNPs發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光猝滅;加入Pb2+后，酶鏈活性被激活，將基底鏈裂解成兩部分，阻止了熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，熒光信號(hào)增強(qiáng)，該傳感器檢測(cè)下限達(dá)到5 nmol/L。

圖2 基于“熒光打開”的Pb2+檢測(cè)原理圖Fig 2 Principle diagram of Pb2+detection based on“fluorescence turn on”

Zhan S S等人［11］用羧基熒光素標(biāo)記富含G的寡核苷酸序列T30695設(shè)計(jì)了一種基于“熒光關(guān)閉”的Pb2+生物傳感器，其中T30695是一種Pb2+特異性識(shí)別分子。如圖3所示，當(dāng)沒有Pb2+時(shí)，T30695呈現(xiàn)自由卷曲狀，并且伴隨著強(qiáng)烈的熒光強(qiáng)度，當(dāng)加入Pb2+時(shí)，T30695形成了Pb2+穩(wěn)定的G-四聯(lián)體，使熒光素和Pb2+之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了明顯的熒光猝滅現(xiàn)象。該方法對(duì)Pb2+的檢測(cè)下限為3.8 nmol/L。此外，根據(jù)熒光物質(zhì)ZnPP-IX（鋅原卟啉—9）可以和G-四聯(lián)體結(jié)合，增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，而不能與雙鏈DNA發(fā)生這種作用，Li T等人［12］報(bào)道了一種Pb2+熒光傳感器:在T30695和其部分互補(bǔ)序列組成的雙鏈DNA和Zn-PP-IX溶液中加入Pb2+，雙鏈被打開，Pb2+和T30695形成G-四聯(lián)體，然后與ZnPP-IX發(fā)生結(jié)合，熒光打開;當(dāng)加入一種強(qiáng)的 Pb2+螯合劑 DOTA（1，4，7，10—四氮雜環(huán)十二烷—1，4，7，10—四乙酸）時(shí)，Pb2+和 DOTA 結(jié)合，DNA 又變成雙鏈結(jié)構(gòu)，ZnPP-IX釋放到溶液中，熒光消失。該傳感器可重復(fù)使用，檢測(cè)下限為20 nmol/L。

圖3 基于“熒光關(guān)閉”的Pb2+檢測(cè)原理圖Fig 3 Principle diagram of Pb2+detection based on“fluorescence turn off”

熒光適配體傳感器具有靈敏度高，分析線性范圍寬，特性參數(shù)較多，選擇性更好等優(yōu)點(diǎn)，但是，熒光標(biāo)記中常用的熒光染料如熒光素、羅丹明等仍然具有局限性，如熒光強(qiáng)度較低、易被光漂白，限制了其應(yīng)用的靈敏性，因此，在熒光染料的選擇方面應(yīng)加以改進(jìn)［13］。

3 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器是依據(jù)電化學(xué)分析方法和原理構(gòu)建的，通過測(cè)定溶液中電流、電位、電量等物理量來確定參與反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)的量?；贒NA修飾電極的電化學(xué)傳感器是Pb2+檢測(cè)的研究熱點(diǎn)［14］，主要是利用自組裝方法將Pb2+特異性識(shí)別DNA分子探針固定到電極表面，通過DNA和Pb2+作用造成的DNA構(gòu)象的變化，使得DNA分子上電活性基團(tuán)的電化學(xué)響應(yīng)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)Pb2+的高靈敏檢測(cè)。

Li F等人［15］根據(jù)目標(biāo)物導(dǎo)致DNA鏈的釋放提出了一種高選擇性、高靈敏度脈沖電流檢測(cè)Pb2+的方法。如圖4所示，首先通過直接沉積法將AuNPs修飾在Au電極表面，增大電極表面積，增加固定的DNA捕獲探針數(shù)量。DNA捕獲探針和T30695雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，亞甲藍(lán)MB（一種芳香雜環(huán)，常用做電化學(xué)雜交指示劑）可以通過嵌入與雙鏈DNA結(jié)合，形成可測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)加入Pb2+時(shí)，Pb2+和T30695形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，使T30695從電極表面釋放到溶液中，并伴隨著亞甲藍(lán)的釋放，導(dǎo)致電信號(hào)減弱。該傳感器的檢測(cè)下限達(dá)0.075 nmol/L，靈敏度高，選擇性好。

除了運(yùn)用修飾電極外，Zhuang J等人［16］基于DNAzyme和二茂鐵標(biāo)記的DNA發(fā)卡的雜交鏈反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種磁控電化學(xué)Pb2+傳感器。該傳感器是將 Pb2+特異性結(jié)合DNAzyme作為識(shí)別元件修飾到在磁珠上，當(dāng)加入Pb2+時(shí)，基底鏈被催化裂解，導(dǎo)致磁珠上的酶鏈通過堿基互補(bǔ)啟動(dòng)鏈捕獲。啟動(dòng)鏈的捕獲觸發(fā)了二茂鐵標(biāo)記的交替的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的雜交鏈反應(yīng)并在磁珠上形成一個(gè)帶有缺口的雙螺旋結(jié)構(gòu)。大量的二茂鐵分子聚集在探針上，并且伴隨著電化學(xué)信號(hào)的變化。最佳化條件下，隨著Pb2+濃度的增加，該P(yáng)b2+傳感器的電化學(xué)信號(hào)也增加，并且和Pb2+濃度在0.1～75 nmol/L內(nèi)呈線性比例，檢測(cè)下限為37 pmol/L。

基于DNA修飾電極的Pb2+電化學(xué)生物傳感器具有較高的檢測(cè)靈敏度，甚至達(dá)到pmol級(jí)，但是這類傳感器中也存在一些問題，例如:單鏈DNA與其他非目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合會(huì)形成雜交假象，干擾目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，另外受溫度影響較大。

表1列出了其他的一些基于上述3種方法的Pb2+生物傳感器。

表1 其他的基于比色、熒光、電化學(xué)方法的Pb2+生物傳感器Tab 1 The other Pb2+biosensors based on colorimetric，fluorescence，electrochemistry method

其中，rGO-SPCE為基于石墨烯修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極。

4 結(jié)束語

本文綜述了近年來比色、熒光、電化學(xué)3種Pb2+傳感器的研究現(xiàn)狀。這3種傳感器在Pb2+的檢測(cè)中各具優(yōu)缺點(diǎn)，熒光法和電化學(xué)方法較比色法靈敏度更高，但是前2種方法由于需要儀器輔助，故不適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。比色法由于操作簡(jiǎn)單且無需輔助儀器，是一種非常適合現(xiàn)場(chǎng)篩查和應(yīng)急使用的潛在方法［27］。鑒于靈敏度不高和選擇性不佳的缺點(diǎn)，今后應(yīng)從2方面加以改進(jìn):一方面針對(duì)選擇性問題，應(yīng)選擇對(duì)Pb2+具有高特異性的識(shí)別分子，如，應(yīng)用于熒光和電化學(xué)傳感器的Pb2+特異性結(jié)合的富含G的核苷酸序列（T30695，PS2.M 等［28］）可推廣的比色傳感器中，或通過化學(xué)合成獲得對(duì)Pb2+具有高選擇性的有機(jī)分子。另一方面，對(duì)于靈敏度的提高，可以考慮引入一些信號(hào)增強(qiáng)物質(zhì)，如，液晶、磁珠等，或?qū)⒍喾N方法相結(jié)合，例如:與動(dòng)態(tài)光散射結(jié)合可以顯著提高比色傳感器的靈敏度［29，30］。因此，通過對(duì)現(xiàn)有傳感器的不斷完善，開發(fā)出靈敏度更高、選擇性更好，更適合于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的便攜式低成本微型化傳感器是未來的發(fā)展方向。

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