李海平，陳瑞戰(zhàn)，金辰光，劉小娜

虎眼萬(wàn)年青(俗稱葫蘆蘭)，為多年生草本植物，原產(chǎn)于非洲南部。20世紀(jì)70年代，虎眼萬(wàn)年青以一種觀賞植物被引進(jìn)中國(guó)，并在海南、西安、長(zhǎng)白山等地區(qū)試栽［1］。大量研究發(fā)現(xiàn)，虎眼萬(wàn)年青多糖及配糖體通過(guò)非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)機(jī)體具有顯著的免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用，有抗氧化、抗衰老、抗病毒和抗腫瘤等藥理活性［2－3］?；⒀廴f(wàn)年青多糖常用的提取方法是熱回流提取，該方法具有時(shí)間長(zhǎng)、溫度高、能耗高、提取率較低等缺點(diǎn)，且過(guò)高的溫度、較長(zhǎng)的提取時(shí)間易引起多糖的結(jié)構(gòu)變化［4］。超聲波是指頻率為2×104～2×109Hz的聲波。超聲提取是通過(guò)一定頻率的大量超聲波作用于提取液時(shí)，溶液中尺寸適宜的小泡產(chǎn)生共振，小泡隨聲波的變化而迅速脹大和壓縮，從而產(chǎn)生高壓沖擊波。這種強(qiáng)烈的沖擊作用能使超聲提取方法大幅度地提高有效成分的提取率［5］，但過(guò)強(qiáng)的超聲功率、較高超聲溫度也可能引起多糖結(jié)構(gòu)變化和活性的降低。因此，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲波提取虎眼萬(wàn)年青多糖并用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以縮短時(shí)間、提高提取率、降低能量消耗，為高活性多糖的生產(chǎn)提供一種高效的提取工藝，為多糖的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

虎眼萬(wàn)年(青鱗莖)由長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SL－2010N多頻超聲波細(xì)胞粉碎儀(南京順流儀器有限公司);UV－2401紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);DZ－2BCII真空干燥箱 (天津泰斯特);RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (德國(guó)IKA公司);GSY－11型恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);FD－1－50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);TDL－40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHB－B88循環(huán)水式多用真空泵(菏澤市生化儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

虎眼萬(wàn)年青鱗莖真空干燥24h，粉碎成粉末，用石油醚回流脫脂、脫色兩次，每次2h，抽濾，濾渣揮干溶劑備用。

1.2.2 多糖超聲提取

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理樣品5g于提取瓶中，加入蒸餾水150mL，浸泡6h，用多頻超聲波細(xì)胞粉碎儀，在提取時(shí)間(10～50min)、溫度(40～80℃)、超聲功率(600～1200W)條件下超聲提取;提取液濃縮至一定體積，加入乙醇至最終為75%(乙醇)，在4℃溫度下沉化36h，減壓過(guò)濾，沉淀用蒸餾水溶解，除去游離蛋白質(zhì)，用蒸餾水透析48h，除去寡糖、單糖、無(wú)機(jī)鹽等小分子，凍干得粗多糖，用苯酚－硫酸法測(cè)量多糖含量［6］，計(jì)算出提取得率。提取得率(%)=(虎眼萬(wàn)年青多糖質(zhì)量/虎眼萬(wàn)年青原料質(zhì)量)×100%。

1.2.3 多糖含量測(cè)定

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1g，溶解后定容成50mL，然后稀釋成0.25mg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于15mL 比色管中，加蒸餾水至 2.0mL，再分別加入 5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，加入濃H2SO45mL，置于沸水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，在490nm波長(zhǎng)下，以試劑空白(2mL蒸餾水代替葡萄糖溶液)為參比，測(cè)定吸光值。得線性回歸方程為:

A=5.3417C+0.4727， 相關(guān)系數(shù) R2=0.9948，

式中，A為吸光度;C為測(cè)定液濃度(mg·mL－1)。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以多糖提取得率為指標(biāo)，分別考察超聲時(shí)間 (10、20、30、40、50min)、提取溫度 (40、50、60、70、80℃)、超聲功率 (600、750、900、1050、1200W)和溶劑原料比(20、30、40、50、60mL·g－1)對(duì)虎眼萬(wàn)年青多糖提取得率的影響。

1.2.5 提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box－Benhnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以超聲時(shí)間 (X1)、提取溫度 (X2)、超聲功率(X3)和溶劑原料比(X4)為考察變量，以虎眼萬(wàn)年青粗多糖提取得率 (Y)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design－Expert 6.0軟件，建立數(shù)學(xué)回歸模型，確定最佳超聲輔助提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、提取溫度60℃、超聲功率1050W，考察超聲時(shí)間10、20、30、40、50min對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖1(a)所示。由圖1(a)可看出，超聲時(shí)間在30min內(nèi)，多糖提取得率會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大;但超聲時(shí)間超過(guò)30min后，提取得率有所降低。由于超聲波可以提高水分子滲透到固體組織內(nèi)部和細(xì)胞內(nèi)多糖在水中溶解以及向周?chē)軇U(kuò)散的速率，在較短的時(shí)間內(nèi)多糖從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到外部的水中。但是，較長(zhǎng)的超聲時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致部分多糖的分解，多糖的提取率會(huì)隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。有學(xué)者認(rèn)為這部分多糖可能分解成一些游離的小分子糖［7］。因此，超聲提取最佳時(shí)間選擇30min較為合適。

2.1.2 超聲溫度對(duì)多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、超聲時(shí)間30min、超聲功率 1050W，考察超聲溫度 40、50、60、70、80℃對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖1(b)所示。由圖1(b)可看出，在40～60℃溫度范圍內(nèi)，多糖提取得率隨溫度的增加而增加;但超過(guò)60℃后，多糖提取得率隨溫度增加而降低。說(shuō)明在一定的提取溫度范圍內(nèi)，多糖的溶解度會(huì)隨著溫度的升高而增大，提取得率增加;但提取溫度升高達(dá)到一定程度時(shí)，可能會(huì)引起部分多糖水解為單糖或低聚糖，從而導(dǎo)致多糖的提取率下降。所以，采用超聲輔助提取虎眼萬(wàn)年青多糖時(shí)，選用60℃左右的溫度比較適宜。

2.1.3 超聲功率對(duì)多糖提取得率的影響

固定溶劑原料比30mL·g－1、提取溫度60℃、超聲時(shí)間 30min，考察超聲提取功率600、750、900、1050、1200W對(duì)提取得率的影響，結(jié)果如圖1(c)所示。由圖1(c)可以看到，超聲功率在600～1050W內(nèi)，多糖得率隨超聲功率的增加而增加;但功率超過(guò)1050W時(shí)，多糖得率隨功率增加反而開(kāi)始降低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，超聲波具有無(wú)選擇性的破壞作用。在高功率下，超聲空化作用強(qiáng)，不僅能破壞細(xì)胞壁，也能破壞欲提取物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，造成提取率下降［8］;而且對(duì)于多糖來(lái)說(shuō)，超聲作用效果與超聲功率、多糖的結(jié)構(gòu)與活性有關(guān)。所以，超聲頻率選用1050W較為適宜。

2.1.4 溶劑原料比對(duì)多糖提取率的影響

超聲時(shí)間 30min、提取溫度60℃、超聲功率 1050W，考察溶劑原料比20、30、40、50、60mL·g－1對(duì)多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖1(d)顯示。圖1(d)顯示，多糖提取得率隨溶劑原料比的增大而增加，當(dāng)溶劑原料比高于40mL·g－1時(shí)，多糖提取率開(kāi)始下降。原因可能是溶劑原料比過(guò)低會(huì)導(dǎo)致多糖的溶解不充分，也不利于細(xì)胞內(nèi)多糖向周?chē)崛∪軇┑臄U(kuò)散;當(dāng)溶劑原料比過(guò)大時(shí)，在超聲功率和超聲時(shí)間一定的條件下，單位體積的提取溶劑吸收的超聲能量會(huì)大幅降低，超聲波引起的空化、機(jī)械、熱效應(yīng)也會(huì)降低，最終導(dǎo)致多糖的提取得率下降。所以，溶劑原料比選擇為40mL·g－1。

圖1 單因素對(duì)提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box－Behnken設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、超聲功率(X3)以及溶劑原料比(X4)4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以虎眼萬(wàn)年青粗多糖提取得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。根據(jù) Box－Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案［9］，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.2 回歸方程的構(gòu)建和方差分析

通過(guò)SAS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)表2中的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。以虎眼萬(wàn)年青粗多糖的提取得率(Y)為因變量，超聲時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、超聲功率(X3)以及溶劑原料比(X4)為自變量，進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程:

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行F檢驗(yàn)，判定回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性。概率越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果

由表3可看出，模型Pr＞F值＜0.0001，說(shuō)明該模型極顯著，不同因素間的差異顯著，證明該回歸模型能夠較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.9127，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有91.27%來(lái)源于所選因變量的變化，說(shuō)明模型試驗(yàn)誤差小，擬合程度良好。在所選因素和水平范圍內(nèi)，對(duì)響應(yīng)值的影響次序?yàn)?提取溫度二次方項(xiàng)(X22)＞超聲功率二次方項(xiàng)()＞溶劑原料比的一次項(xiàng)(X4)＞溶劑原料比的二次方項(xiàng))＞提取溫度的一次項(xiàng)(X2)＞超聲時(shí)間二次方項(xiàng)(X12)＞超聲功率的一次項(xiàng)(X3)＞超聲時(shí)間的一次項(xiàng)(X1)＞超聲時(shí)間和提取溫度的交互項(xiàng)(X1X2)。其它因素對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著(p＞0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

超聲提取過(guò)程中，超聲時(shí)間、提取溫度、超聲功率以及溶劑原料比對(duì)提取得率影響的三維響應(yīng)曲面如圖2所示。固定超聲功率1050W、溶劑原料比40 mL·g－1，超聲時(shí)間和提取溫度對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(a)所示，在20～35min超聲時(shí)間內(nèi)延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于多糖的提取，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)35min后隨時(shí)間增加提取得率緩慢降低，發(fā)生這一現(xiàn)象的可能原因是長(zhǎng)的超聲時(shí)間(較高的溫度)導(dǎo)致多糖的降解［10］。在50～65.8℃范圍內(nèi)，隨溫度的增加提取得率快速增加;提取溫度超過(guò)65.8℃時(shí)，隨溫度的增加提取得率快速降低，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因除了在較高的溫度和較強(qiáng)的超聲波作用多糖可能降解之外，另一方面是隨溫度的升高，超聲波的空化效應(yīng)降低，從而導(dǎo)致提取得率降低［11］。綜合看來(lái)，相對(duì)較長(zhǎng)的超聲時(shí)間和較高的提取溫度對(duì)增加提取得率是有利的，提取溫度較超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響相對(duì)較大。

超聲時(shí)間與超聲功率對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(b)所示。由圖2(b)可以看到，超聲時(shí)間和超聲功率的等值線圖呈現(xiàn)顯著的橢圓形，說(shuō)明二者的交互作用相對(duì)較強(qiáng)。在超聲時(shí)間20～33.5min和超聲功率900～1100W范圍內(nèi)，提取得率隨超聲時(shí)間和功率的增加而增加;之后隨超聲時(shí)間和超聲功率的增加，提取得率逐漸降低。說(shuō)明在較強(qiáng)的超聲功率作用下，在短的超聲時(shí)間內(nèi)多糖的溶解和擴(kuò)散即可達(dá)到平衡，而過(guò)高的超聲功率和長(zhǎng)的超聲時(shí)間共同的作用結(jié)果會(huì)導(dǎo)致提取得率的降低。超聲功率相對(duì)較超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響較大。

圖2 三維響應(yīng)曲面圖

超聲時(shí)間與溶劑原料比對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(c)所示。由圖2(c)可以看到，在超聲時(shí)間20～30min和溶劑原料比30～41.5mL·g－1范圍內(nèi)，提取得率隨超聲時(shí)間和溶劑原料比的增加逐漸增加;之后隨超聲時(shí)間和溶劑料液比的增加緩慢降低。表明在一定的范圍內(nèi)增加超聲時(shí)間和溶劑原料液比都有利于提取得率的增加，但過(guò)分增加會(huì)導(dǎo)致提取得率的降低，適宜的超聲時(shí)間和溶劑原料比對(duì)虎眼萬(wàn)年青多糖的提取是十分必要的。綜合分析可以看到超聲時(shí)間和溶劑原料比對(duì)提取得率的影響相對(duì)較小。

提取溫度與超聲功率對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(d)所示。由圖2(d)可以看出，在50～62℃和900～1060W的范圍內(nèi)，提取得率隨溫度和超聲功率的增加快速增加，超過(guò)這一范圍后逐漸降低。說(shuō)明在一定的范圍內(nèi)增加超聲功率和提取溫度都有利于提取得率的增加，但過(guò)高的提取溫度和超聲功率共同作用的結(jié)果會(huì)導(dǎo)致多糖的降解、提取得率的降低，所以應(yīng)選擇適應(yīng)的超聲功率和提取溫度。從圖形分析看，溫度對(duì)提取得率的影響高于超聲功率。

提取溫度與溶劑原料比對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(e)所示。由圖2(e)可以看出，在50～62.5℃和30～43mL·g－1的范圍內(nèi)，提取得率隨提取溫度和溶劑原料比的增加逐漸增加，之后會(huì)隨二者增加而逐漸降低，原因是在一定范圍內(nèi)增加溶劑原料比和提高溫度，都利于多糖的溶解和擴(kuò)散，增加提取得率;但溶劑原料比過(guò)大時(shí)，超聲波能量會(huì)被溶劑緩釋?zhuān)饔眯Ч档?，造成多糖的提取得率下降?/p>

超聲功率與溶劑原料比對(duì)提取得率的交互影響的響應(yīng)曲面如圖2(f)所示。在900～1100W和30～45mL·g－1范圍內(nèi)，多糖提取得率隨超聲功率和溶劑原料比的增加而逐漸增加;之后又會(huì)隨著超聲功率和溶劑原料比的增加而降低。說(shuō)明在超聲功率過(guò)大時(shí)，提取物的分子結(jié)構(gòu)也會(huì)被破壞;而溶劑原料比過(guò)大時(shí)，超聲波輻射能會(huì)被溶劑緩釋?zhuān)苟嗵翘崛÷式档汀?/p>

2.2.4 最優(yōu)提取工藝的確定

通過(guò)對(duì)響應(yīng)曲面圖以及利用Design－Expert 6.0的軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析，確定了超聲輔助提取虎眼萬(wàn)年青多糖的最優(yōu)提取條件:超聲時(shí)間30.05min、提取溫度59.47℃、超聲功率1059.15W、溶劑原料比40.11mL·g－1，該條件下虎眼萬(wàn)年青多糖理論提取得率為50.12%?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，把上述優(yōu)化提取條件修正為超聲時(shí)間30min、提取溫度60℃、超聲功率1050W、溶劑原料比40mL·g－1，重復(fù)5次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到虎眼萬(wàn)年青粗多糖平均提取得率為50.06%，相對(duì)預(yù)測(cè)值的誤差0.06%，相對(duì)誤差小于1%，驗(yàn)證了模型的可行性。所以，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取虎眼萬(wàn)年青多糖獲得的工藝參數(shù)是可靠的，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析，建立了超聲提取虎眼萬(wàn)年青多糖的回歸模型;經(jīng)過(guò)方差分析建立的模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)誤差較小，可以用于提取得率的預(yù)測(cè)分析;通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化出最佳提取條件:超聲時(shí)間30.05min、提取溫度59.47℃、超聲功率1059.15W、溶劑原料比40mL·g－1。按此工藝條件，虎眼萬(wàn)年青多糖實(shí)驗(yàn)提取得率接近于模型的預(yù)測(cè)得率，說(shuō)明優(yōu)化得到的條件可靠，該模型具有較高的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。本研究為植物多糖的生產(chǎn)供了一種有效的方法，為多糖的開(kāi)發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

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