戴 勤 ，俞建妹 ，譚 玲，黃松殿 ，楊 梅 ，梁小春

（1.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.南寧市良鳳江國家森林公園，廣西 南寧 530031）

擎天樹初始外植體總酚含量與PPO活性的關(guān)系

戴 勤1，俞建妹2，譚 玲1，黃松殿2，楊 梅1，梁小春2

（1.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.南寧市良鳳江國家森林公園，廣西 南寧 530031）

以擎天樹當(dāng)年生嫩枝為材料，分析外植體在消毒及啟動培養(yǎng)過程中總酚含量與PPO活性關(guān)系，為擎天樹褐變機(jī)理研究、建立種質(zhì)資源保存新途徑提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：（1）擎天樹總酚含量與褐變呈正相關(guān)，培養(yǎng)基中添加PVP 2.0g/L及黑暗處理下褐變程度較弱，總酚含量低；不添加抗褐化劑處理褐變最嚴(yán)重，總酚含量最高；（2）外植體材料不同褐化程度下的PPO活性均很低，為0.15～0.3U之間，且不同抗褐化劑及黑暗與否等處理間無明顯變化；（3）外植體總酚含量隨培養(yǎng)時間增加呈先降后升趨勢，各處理下PPO活性隨培養(yǎng)時間增加趨于一致。

擎天樹；組織培養(yǎng)；褐化；總酚；PPO 活性

在組織培養(yǎng)過程中，褐化是阻礙植株再生的重要因素之一，植物體內(nèi)酚類物質(zhì)被氧化成褐色的醌類物質(zhì)，褐變產(chǎn)物對許多酶有抑制作用從而影響組培材料生長，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡。組織培養(yǎng)中褐變程度與植物材料老化程度、基因型、培養(yǎng)條件等有密切關(guān)系，而木本植物褐化研究主要在基因型、植物年齡、采集季節(jié)、添加抗褐化劑等方面，其中以速生樹種的研究較深入，并已解決了組培褐化的問題，如東門林場尾赤桉D2、D5、D6三個無性系中D5褐化率最低[1]，但仍有些無性系去除褐化存在困難。其他易褐化樹種主要受基因型、培養(yǎng)條件影響較大，核桃組培褐化程度受取材季節(jié)、基因型影響較大[2]，桑樹則可通過嫩枝在低鹽培養(yǎng)基中，經(jīng)低溫、暗處里有效減輕褐變現(xiàn)象[3]。

擎天樹樹體高大，干形圓滿通直，加工性能良好，是一種優(yōu)良的工業(yè)用材樹種[4]。由于擎天樹分布區(qū)域較小，種子成苗率低，幼苗生長緩慢，群落結(jié)構(gòu)散亂、混雜，受著強(qiáng)烈的人為干擾，以及對擎天樹的過度利用，致使其成為珍稀瀕危樹種[5]，目前在群落結(jié)構(gòu)、育苗技術(shù)、莖葉解剖、遺傳多樣性等方面開展了研究[6-8]，但對無性繁殖技術(shù)的研究較少。組培快繁技術(shù)具有增產(chǎn)效益顯著的優(yōu)勢，可以快速擴(kuò)大苗木產(chǎn)量、提高良種壯苗質(zhì)量，為擎天樹種質(zhì)資源提供重要保障。本課題組對擎天樹的組織培養(yǎng)已開展研究，解決了其外植體高污染率的問題，但發(fā)現(xiàn)其外植體極易褐化，而且短時間內(nèi)褐化很嚴(yán)重，隨著培養(yǎng)時間的推移褐化加劇，并且次氯酸鈉可加速褐化過程[9]，成為制約擎天樹外植體啟動及增殖培養(yǎng)的阻礙因子。一些學(xué)者報道植物褐變與總酚含量及PPO活性之間有密切關(guān)系[10]，但擎天樹外植體總酚含量及PPO酶活性是否與褐化有相關(guān)關(guān)系尚未見報道。本研究以擎天樹莖段為試驗材料，測定和分析擎天樹外植體在消毒及啟動培養(yǎng)階段的總酚含量及PPO活性與褐變現(xiàn)象的關(guān)系，為進(jìn)一步探討擎天樹外植體的褐變機(jī)理、優(yōu)化消毒處理及培養(yǎng)基配方提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗外植體材料采于廣西良鳳江國家森林公園，分別采集長勢優(yōu)良的擎天樹當(dāng)年生枝條上帶芽幼嫩莖段。采摘的種子放入樣品袋中密封保存，帶回實(shí)驗室后用紗布包好放入冰箱4℃保存；莖段放入裝有0.1%多菌靈溶液的塑料桶中保存，并蓋上遮陰布防止樣品失水。帶回實(shí)驗室后立刻進(jìn)行預(yù)處理：將枝條修剪成帶2～3個葉芽的短枝，葉柄保留3 mm左右，洗滌液浸泡10 min后用軟毛刷刷凈，用自來水充分沖洗2～3 h后作為試驗材料。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 消毒處理

將預(yù)處理好的材料依次進(jìn)行青霉素600萬單位60 min、75%乙醇、升汞0.1%4 min消毒處理，分別對消毒前后的莖段外植體進(jìn)行總酚含量及PPO活性的測定，消毒后的測定結(jié)果作為擎天樹總酚含量及PPO活性的初始值。

1.2.2 黑暗處理

莖段消毒后接入1/2MS+6-BA0.4 mg/L+IBA0.3 mg/L+PVP2 g/L+瓊脂5.5 g/L+糖30 g/L培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行黑暗及不遮光處理。與接種后第2天及第7天測定總酚含量及PPO活性。

1.2.3 培養(yǎng)時間對比

莖段外植體消毒后接入1/2MS+6-BA0.4 mg/L+ IBA0.3 mg/L+PVP2 g/L+瓊脂5.5 g/L+糖30 g/L培養(yǎng)基中，采用暗處理。于接種后第2天、第4天及第7天測定總酚含量及PPO活性。

1.2.4 抗褐化劑處理

以1/2MS+6-BA0.4 mg/L +IBA0.3 mg/L +瓊脂5.5 g/L+糖30 g/L為基本培養(yǎng)基，分別添加PVP2 g/L、AC0.5 g/L+VC0.2 mg/L、AC0.5 g/L+VC0.2 mg/L+PVP2 g/L的抗褐化劑，以不添加抗褐化劑作對照，均采用黑暗處理。于接種后第2天及第7天測定總酚含量及PPO活性。

1.3 測定方法

總酚含量測定采用福林酚顯色法[11]，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=25.311x+0.175，R2=0.9992。

多酚氧化酶（PPO）活性測定參照盧緒娟等[12]的研究方法，以每分鐘每克樣品吸光度值變化0.001為1個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒對總酚含量及PPO活性的影響

為探究消毒對擎天樹的總酚含量及PPO活性的影響，論證褐變與總酚含量與PPO活性的關(guān)系，試驗分別對預(yù)處理后及消毒后的外植體莖段進(jìn)行總酚含量及PPO活性測定。由圖1、圖2可知，材料消毒后的總酚含量為125.85 mg/g大于消毒前的114.21 mg/g，PPO活性則表現(xiàn)為是消毒前高出消毒后0.021 U，其活性高時總酚含量少，活性低時總酚含量升高，并且消毒環(huán)節(jié)使PPO活性降低，但二者前后對比差異均不顯著。

圖1 消毒前后外植體總酚含量Fig.1 Total phenolics contents before and after disinfection

2.2 黑暗處理對莖段外植體總酚含量的影響

圖2 消毒前后外植體PPO活性Fig.2 PPO activities of before and after disinfection

培養(yǎng)過程中光照變化對材料褐變有影響，接種后進(jìn)行必要的暗處理，能有效減弱褐化現(xiàn)象[13]。為進(jìn)一步論證擎天樹的總酚含量與褐變之間的關(guān)系，試驗以莖段消毒后的總酚含量125.85 mg/g做初始值，分別測定黑暗及光照處理下的總酚含量，結(jié)果如圖3所示。由于試驗中材料褐化率較高，幾乎所有材料均有不同程度的褐化，但兩種處理下總酚含量差異顯著，第2天、第7天材料總酚含量均下降，光照處理下滲出培養(yǎng)基的褐色物質(zhì)直徑約為1.0 cm，黑暗處理下滲出培養(yǎng)基的褐色物質(zhì)直徑約為0.8 cm，黑暗處理下總酚含量與光照處理對比分別下降18.98 mg/g及17.04 mg/g，第7天時兩個處理較第2天總酚含量稍有升高。光照處理下的總酚含量較黑暗處理下的高，說明總酚含量高，褐變嚴(yán)重，黑暗處理能緩解擎天樹外植體褐化。

圖3 黑暗及光照處理下外植體總酚含量Fig.3 Total phenolics contents of explants treated with dark and light treatment

2.3 培養(yǎng)時間對莖段外植體總酚含量的影響

如圖4所示，培養(yǎng)時間對總酚含量的影響極顯著。材料在培養(yǎng)第2天時總酚含量降低至94.84 mg/g，并在培養(yǎng)的第4天降到最低為80.28 mg/g，而后總酚含量有所增加。擎天樹在短時間內(nèi)會迅速呈現(xiàn)較嚴(yán)重的褐變，總酚參與了褐變的過程，故接種后第二天的總酚含量相比第一天有所下降，并在一定時間內(nèi)隨時間的延長而不斷降低。

圖4 不同培養(yǎng)時間下外植體總酚含量Fig.4 Total phenolics contents of explants treated with different culture time

2.4 抗褐化劑對莖段外植體總酚含量的影響

外植體消毒后測定的總酚含量作為原始值，與第2天和第7天的總酚含量進(jìn)行方差分析及多重比較。從表5可以看出，在培養(yǎng)的第2天，所有處理總酚含量均值較原始值有所降低，其中以添加 PVP2.0 g/L +VC0.2 mg/L+AC0.5 g/L的處理下降最多，總酚含量僅為89.39 mg/g，培養(yǎng)基上褐變斑塊最小直徑約0.6 cm；培養(yǎng)第7天時，總酚含量較第2天高，添加有PVP物質(zhì)的兩個處理與其他處理差異顯著，第7天時添加 PVP2.0 g/L處理下總酚含量為100.06 mg/g，褐變斑塊直徑約0.6 cm添加PVP2.0 g/L+VC0.2 mg/L+AC0.5 g/L的處理總分含量為112.10 mg/g，褐變斑塊最小直徑約0.7cm，未添加任何抗褐化劑的處理總酚含量最高，為121.72 mg/g，認(rèn)為培養(yǎng)基添加PVP2.0 g/L的抗褐化效果較好。

圖5 不同抗褐化處理下外植體總酚含量Fig.5 Total phenolics contents of explants treated with different kinds of anti-browning agents

2.5 不同培養(yǎng)時間下光照及不同抗褐化劑處理對莖段外植體PPO活性的影響

消毒后對上述黑暗處理、不同時間對比、抗褐化劑處理的外植體材料進(jìn)行PPO活性測定，結(jié)果見圖6，擎天樹PPO活性不大，第2天時，添加PVP2.0 g/L光照處理的PPO活性最大為0.301 U，暗處里PPO活性菌比其低，而未添加抗褐化劑及PVP2.0 g/L處理PPO活性比第一天還低，最小為0.160 U，在培養(yǎng)第7天各處理PPO活性趨于一致，活性最大的處理與活性最小處理差值僅有0.036 U。多種不同處理下的PPO活性對比說明酶活性的高低不能作為判斷擎天樹外植體褐變情況的主要依據(jù)，羅曉芳等對阿月渾子多酚氧化酶活性研究也發(fā)現(xiàn)，褐變嚴(yán)重的阿月渾子多酚氧化酶活性很低[14]。

圖6 不同處理方式下外植體PPO活性Fig.6 PPO activities of explants treated with different kinds of treatment methods

3 討 論

酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)一種次生代謝產(chǎn)物，在酶的作用下氧化從而引起顏色的改變[15-17]，是褐化發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，多酚氧化酶包括多種酶，且具有專一性，常被認(rèn)為與植物褐化現(xiàn)象有密切關(guān)系，適宜的抗褐化可有效防止外植體褐變，根據(jù)其作用原理不同一般分為還原型如VC，在酶催化作用時消耗溶解氧，使得酚類物質(zhì)不被氧化，以及吸附型如PVP、活性炭以物理性吸附酚類為主。木本植物褐化現(xiàn)象較普遍，如華蓋木極易褐化，在接種后PPO活性快速增加，隨后活性又大幅度下降之后下降速度減緩，其總酚含量與PPO趨勢相似但時間滯后[18]；鄭超等研究曼地亞紅豆杉時認(rèn)為愈傷組織褐化程度與總酚含量呈顯著正相關(guān),而總酚含量與PPO、POD活性則呈負(fù)相關(guān)[19]；紅花玉蘭研究中認(rèn)為低溫遮光處理后轉(zhuǎn)入25℃的全光照下培養(yǎng)可以有效抑制其褐化[20]。有研究發(fā)現(xiàn)擎天樹分泌細(xì)胞普遍存在于各薄壁細(xì)胞群中，分泌系統(tǒng)發(fā)達(dá)[7]；梁機(jī)等提出擎天樹種子含有抑制種子萌發(fā)、生長的成分[21]，但是其分泌物成分、含量并未有相關(guān)報道，其是否與擎天樹強(qiáng)烈的褐化現(xiàn)象有關(guān)仍有待研究。

本試驗測定了不同處理下擎天樹組織培養(yǎng)過程總酚含量、PPO活性，材料消毒環(huán)節(jié)對總酚含量、PPO活性影響不顯著，接種后期總酚含量與擎天樹的褐變有很大關(guān)系，暗處里對控制材料褐化效果較好，可能是因為擎天樹體內(nèi)酶系統(tǒng)具有光活性，在光照條件下加速酚類物質(zhì)的氧化從而能促進(jìn)褐變。外植體總酚含量隨培養(yǎng)時間增加呈先降后升趨勢，與吳銀鳳研究牡丹的紅衣教主品系結(jié)果一致[15]，認(rèn)為其有一個下降的過程是因為外植體中的酚類物質(zhì)參與了酶促褐變反應(yīng)。光照和不同抗褐化劑處理下PPO活性變化很小，僅在第2天相差較多，而在第7天時活性與第一天相近，結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加2.0 g/L的PVP可以減緩莖段外植體的褐化情況，但是效果仍不理想，可以考慮在PVP溶液中對外植體進(jìn)行切割再接種。擎天樹的總酚含量高，但PPO活性低，褐變嚴(yán)重，可能的原因是擎天樹中所含的次生代謝物除酚類物質(zhì)外還有單寧或者類黃酮物質(zhì)，多酚氧化酶不是其酚類物質(zhì)的專一性氧化酶，褐變是由另一種酶引起的。因此擎天樹外植體中含有哪些酚類物質(zhì)、次生代謝物種類，褐變主要是由哪種物質(zhì)氧化引起等問題還需要進(jìn)一步探索，從而為尋找解決擎天樹外植體褐變現(xiàn)象的途徑、為實(shí)現(xiàn)外植體啟動及增殖培養(yǎng)提供正常的繁殖材料。

[1] 張遠(yuǎn)華,吳永富,周國福,等.尾赤桉組培繁殖技術(shù)研究[J].桉樹科技, 2008, (1):24-26.

[2] 王延秀.核桃外植體褐化影響因素及增殖培養(yǎng)研究[D].甘肅:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

[3] 邱 璐,陳善娜,夏躍明,等.桑樹組織培養(yǎng)中褐化問題的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2000,22(1): 76-78.

[4] 閆興富,曹 敏.熱帶雨林瀕危樹種擎天樹的致危原因及保護(hù)策略[J].福建林業(yè)科技,2008,25(1):187-191.

[5] 孟令曾,許再富.中國龍腦香科植物受脅狀況及遷地群落保護(hù)探討[J].廣西植物,2005,25(1):8-13.

[6] 閆興富,曹 敏.不同光照對望天樹種子萌發(fā)和幼苗早期生長的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2007,18(1):23-29.

[7] 朱栗瓊,招禮軍.擎天樹莖葉解剖結(jié)構(gòu)及其環(huán)境適應(yīng)性[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(1):104-108.

[8] 李巧明,何田華,許再富,等.瀕危植物望天樹的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)[J].分子植物育種,2003,1(5-6):819-820.

[9] 韋鳳娟,廖克波,楊 梅,等.擎天樹組培外植體消毒與褐化抑制的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2011,27(31):24-28.

[10] 陳秀芳,王坤范.桃果實(shí)發(fā)育中褐變因子變化規(guī)律的研究[J].園藝學(xué)報,1995,22(3):230-234.

[11] 李騰飛.缺苞箭竹總酚含量及其對大熊貓采食的影響[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2009.

[12] 盧緒娟,豐 震,趙蘭勇,等.平陰玫瑰組培苗多酚含量及多酚氧化酶活性與其生根的關(guān)系[J].園藝學(xué)報, 2007, 34(3):695-698.

[13] 周麗艷,郭振清,秦子禹,等.白玉蘭組織培養(yǎng)中的褐化控制[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報,2008,22(4):19-22.

[14] 羅曉芳,田硯亭,姚洪軍.組織培養(yǎng)過程中PPO活性和總酚含量的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,21(1):98-101.

[15] 吳銀鳳.牡丹初始外植體褐變機(jī)理及影響因素的研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2003.

[16] 杜琳倩,何 鋼,王靜,等.水淹脅迫下新型氧肥對土壤脲酶活性的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(4):66-69.

[17] 司志國,俞小鵬,白玉杰,等.徐州城市綠地表層土壤酶活性及其影響因素[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(2):73-76,80.

[18] 馬 均,馬明東.華蓋木組織培養(yǎng)過程中PPO活性及總酚含量與褐化的關(guān)系研究[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2009,(6):9-10.

[19] 鄭 超,徐 晟,夏 冰,等.三種抗氧化劑對曼地亞紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響[J].植物生理學(xué)報,2013,49(3): 63-67.

[20] 懷慧明.紅花玉蘭變種離體快繁組織培養(yǎng)技術(shù)研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2011.

[21] 梁 機(jī),黃銀珊,蒙好生,等.擎天樹種子水浸提液對4種植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].種子,2012,31(3):39-42.

Relationship total phenolics contents and polyphenol oxidase activities in explant of preliminary culture in Vitro of Parashorea chinensis

DAI Qin1, YU Jian-mei2, TAN Lin1, HUANG Song-dian2, YANG Mei1, LIANG Xiao-chun2
(1.Forestry College of Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China;2. National Forest Park of Liangfengjiang, Nanning 530031, Guangxi, China)

Using shoots fromParashorea chinensisexplants, the regulation of total phenolics contents and polyphenol oxidase activities were studied in the processes of the disinfection and primary culture, which would provide the new references for the browning mechanism and establishment of germplasm conservation. The results were as follows: (1) There was a positive correlation between the total phenolics content and the browning, the browning levels were weaker with both treatments of adding PVP 2.0 g/L into medium and by dark treatment, the total phenolics were lower in the tested explants; while the total phenolics content went up to the top if without any anti-browning agents. (2) The polyphenol oxidase activities were low between 0.15～0.3U and the treatments with different dose of ppo and dark and non-dark, the browning levels had insignif i cant changest. (3) The total phenolics contents showed a fi rst decreased and then increased trend in 2 days, the changing trends of polyphenol oxidase activities tended to converge with the cultural time after induction. The relation between the total phenolics content and the polyphenol oxidase was not obvious.

Parashorea chinensis; tissue culture; browning; total phenolics; polyphenol oxidase activity

S792.99

A

1673-923X(2014)04-0050-04

2013-07-10

廣西林業(yè)廳科技項目（桂林科字201019）；國家高等學(xué)校特色專業(yè)建設(shè)項目（TS1Z097l）

戴 勤（1988-），女，壯族，廣西宜州人，碩士研究生，主要從事植物生理生態(tài)方面研究；E-mail：jenny150@163.com

楊 梅（1970-），女，吉林長春人，從事人工林培育方面的研究工作

[本文編校：吳 彬]