李 雪，葛長明，李海粟，劉 雙，陳 迪，張本月，趙洪顏

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002)

木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的生物資源，約占植物總干重的1/3～1/2，它能夠被微生物降解［1］。秸稈是籽粒收獲后耕地上重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源，吉林省每年有超過0.6億t的秸稈廢棄物資源。由于秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物資源在自然狀態(tài)下極難分解，只能就地丟棄或焚燒，不能歸還土壤。大量待分解的秸稈不僅占用耕地還限制營養(yǎng)元素歸還土壤，而且焚燒產(chǎn)生的煙塵影響生態(tài)環(huán)境和人類健康。因此，如何將秸稈變廢為寶是實現(xiàn)環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題［2］。

崔宗均等突破傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)分離方法，在不破壞自然界中微生物之間協(xié)同關(guān)系的前提下，將酸堿反應(yīng)不同的菌群優(yōu)化組合，篩選和馴化了高效而穩(wěn)定的纖維素分解復(fù)合菌系 MC1、XCD-2、WDC-2 等復(fù)合系［1，3－4］。此復(fù)合系的降解能力遠遠高于純培養(yǎng)的單個菌株，在8 d內(nèi)可完全降解水稻秸稈［5］。而且這些復(fù)合系對在厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中有顯著的優(yōu)勢，但是這些復(fù)合系都是從畜禽糞便堆肥環(huán)境中篩選出來的。因此，該研究是從沼液厭氧環(huán)境中篩選出BCM-9復(fù)合系，為秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的酸化處理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 以筆者實驗室構(gòu)建的木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌系BCM-9作為菌種，培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)，其成分為5 g蛋白胨，5 g NaCl，2 g CaCO3，1 g 酵母粉及1 L 的去離子水。配制800 ml PCS培養(yǎng)基于1 L的三角瓶中，添加8 g水稻秸稈，121℃滅菌15 min。水稻秸稈經(jīng)1.5%NaOH堿液浸泡48 h后，用自來水沖洗到pH為7.0左右，105℃烘干后，將其剪到合適的長度以便放入300 ml的三角瓶中。調(diào)節(jié)pH試驗中，需配制1%、2%、3%NaOH溶液用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH。更換培養(yǎng)基試驗中需配制新鮮的PCS培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)條件 每個300 ml的三角瓶中裝入238 ml PCS培養(yǎng)基，稻稈的添加量分別為培養(yǎng)基體積的5%(W/V)。培養(yǎng)基在121℃下滅菌15 min后備用。將培養(yǎng)3 d的BCM-9菌種按照5%體積的接種量接種到新鮮培養(yǎng)基中，60℃下靜置培養(yǎng)。

1.3 水稻秸稈分解過程中pH的測定 pH的測定方法:取0.2 ml培養(yǎng)液，滴于HORIBA微型pH計(model B-212，HORIBA，Japan)中進行測定。

1.4 BCM-9分解后秸稈各成分測定 將烘干后的秸稈殘渣粉碎并過1 mm的篩子，稱取0.5 g裝入濾袋，3個重復(fù)，按照ANKOM220纖維分析儀操作規(guī)程及技術(shù)資料測定秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。

1.5 BCM-9發(fā)酵液中有機酸含量測定 發(fā)酵液樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22μm 濾膜，在 －40℃冰凍下保存，待樣品收集全后，用島津QP2010型氣相色譜－質(zhì)譜(GC-MS)測定，測定分析柱為CP-Chirasil-Dex CB(25 m×0.25 mm)毛細管柱;柱箱溫度50℃(1 min)→100℃(1 min)，7℃ /min→195℃(2 min)，18 ℃ /min，共14 min;進樣口溫度190℃;檢測器溫度200℃;載氣He(60 kPa)，流量34 ml/min;分流比1/22;監(jiān)測器電壓115 kV;進樣量1μl。對測定的數(shù)據(jù)，利用NIST數(shù)據(jù)庫進行定性分析。根據(jù)出峰物的定性分析結(jié)果，配制相應(yīng)標準樣品的稀釋液作為標準物進樣，用于該物質(zhì)的定量分析［4］。

1.6 纖維素酶和木聚糖酶活力的測定 纖維素酶活力測定和木聚糖酶活力測定參見［2－3］等方法。其中纖維素酶活力單位定義為:酶液在1 min內(nèi)消耗纖維素產(chǎn)生1 mmol葡萄糖作為1 U;木聚糖酶活力單位(IU)定義為1 min水解木聚糖底物生成1μg木糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.7 微生物動態(tài)群落動態(tài)分析 培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心15 min，棄上清收集菌體細胞，按照 Benzyl chloride方法［6］提取微生物的總DNA。16SrDNA的PCR擴增使用AmpliTaq GoldTM(Perkin Elmer，Japan)，引物為 357F-GC(GC clamp-5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和517R(5'-GTGCCAGC(A/C)GCCGCGG-3')。用 PCR 擴增產(chǎn)物進行 DGGE 分析［7－8］。從膠上回收DNA條帶，測定其序列，GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，進行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秸稈降解過程中p H的變化 據(jù)報道，纖維素降解pH 范圍為5.9 ～8.5［6］。由圖1 可知，水稻秸稈降解過程中2 d內(nèi)發(fā)酵液的pH迅速地從7.4下降到6.2，隨著培養(yǎng)時間的增加，pH逐漸上升，第12天時達到8.3。

圖1 水稻秸稈降解過程中pH的變化

2.2 BCM-9分解后秸稈各成分測定結(jié)果 由圖2可知，水稻秸稈的生物量總干重12 d后下降了75%。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成成分的質(zhì)量分別降低了97.11%、74.70%和48.00%。前期研究報道的MC1的降解率為:生物量總干重減少81%，纖維素含量減少99%，半纖維素減少74%，木質(zhì)素減少24%。比較表明，BMC-9和MC1對水稻秸稈的木質(zhì)纖維素具有很強的分解能力。這為BMC-9降解木質(zhì)纖維素沼氣發(fā)酵酸化階段的機制研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 纖維素酶和木聚糖酶活力的測定結(jié)果 為檢測BMC-9對水稻秸稈的降解能力，測定了12 d內(nèi)纖維素酶活性和木聚糖酶活性的變化。結(jié)果表明，木聚糖酶的活性逐漸上升，在第9天時呈現(xiàn)峰值，為1.79 U/ml。纖維素酶活性在第9天達到最大值，0.37 U/ml(圖3)。酶活性的分析表明，BMC-9對水稻秸稈分解能力最強的是在第9天。

2.4 水稻秸稈降解產(chǎn)物分析 BCM-9降解水稻秸稈過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性有機酸分析結(jié)果表明:在第9天揮發(fā)性有機酸的總量達到最高值。在水稻秸稈降解過程中主要的成分是甲酸、乙酸、丙酸和乳酸。第9天時乳酸為0.291 mg/L，甲酸為0.31 mg/L，乙酸為 1.93 mg/L，丙酸為 0.73 mg/L(圖 4)，與酶活性分析的結(jié)果相類似。

圖2 BCM-9分解后秸稈各成分測定結(jié)果

圖3 BCM-9降解水稻秸稈過程中纖維素酶和木聚糖酶活性變化

圖4 水稻秸稈發(fā)酵液中揮發(fā)性有機酸含量分析

2.5 細菌DGGE圖譜分析 在第38代培養(yǎng)過程中的第0、1、3、6、9和12天收集培養(yǎng)液，測定細菌菌群的多樣性。由圖5可知，在DGGE圖中譜條帶的出現(xiàn)和消失表明該種群中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。隨著培養(yǎng)時間的延長，它們的頻帶發(fā)生了顯著變化。DGGE圖譜共出現(xiàn)了16條帶。條帶1、5、14、15和16是第1天到第12 天一直存在的，條帶1、14和15 分別在第1、3、6 和 9 天亮度最高。條帶 2、3、5、6、8 和10出現(xiàn)在整個監(jiān)測過程中。條帶2、5、8的強度逐漸增強，而條帶3、6、10的強度逐漸降低。條帶11和12 在第1、3、9、12天可見，條帶13和占主導(dǎo)地位的微生物種群在第3～12天時以恒定強度出現(xiàn)。根據(jù)這些條帶的出現(xiàn)、消失和強度，可以知道微生物群體的組合物，在發(fā)酵過程中會發(fā)生很大改變［14］。

為了更加清晰地了解微生物群之間的關(guān)系，對條帶切除、純化，并通過PCR擴增、測序。通過NCBI網(wǎng)站進行比對，結(jié)果見表1。16個條帶對應(yīng)3個屬:Bacillus sp.、Clostridium sp.和 Geobacillus sp.，其中條帶12 對應(yīng)于 Geobacillus sp.，它是在微生物群體中最常見的菌株。該屬通常是需氧或兼性厭氧菌，生長在45～70℃的高溫環(huán)境中［5］。條帶1、8、15對應(yīng)的是Bacillus sp.。以前的研究已經(jīng)表明，Bacillus sp.是一種芽孢桿菌屬，可以簡單地將有機化合物分解為無機物。它能夠降解木質(zhì)素生產(chǎn)生物表面劑，促進難降解有機物的微生物分解，提高堆肥效率，縮短堆肥周期。條帶 2、3、4、5、6、7、9、10、11、13、14、16 是 Clostridium sp.，據(jù)報道在堆肥環(huán)境中導(dǎo)致堆體溫度的快速上升，并具備能力降解纖維素［3］。

圖5 細菌DGGE圖譜分析

表1 細菌DGGE條帶16S r RNA序列分析

3 結(jié)論

(1)水稻秸稈降解菌在降解過程中，發(fā)酵液pH先降低后升高，趨于穩(wěn)定。

(2)降解后水稻秸稈的總生物量降低了75%，纖維素降低了97.11%，半纖維素降低了74.70%，木質(zhì)素降低了48.00%。

(3)降解過程中揮發(fā)性脂肪酸、木聚糖酶活、纖維素酶活在第9天時數(shù)值最高。

(4)第9天時，發(fā)酵液中細菌微生物群落最為豐富，分別是 Bacillus sp.、Clostridium sp.和 Geobacillus sp.屬菌株。

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