田 波，尚勇良，武發(fā)菊，安芳蘭，萬(wàn)玉林，劉學(xué)榮*，楊進(jìn)才

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州730000;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046)

隨著獸用生物制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。BHK21細(xì)胞作為WHO推薦的生產(chǎn)獸用疫苗細(xì)胞，現(xiàn)已在規(guī)?；a(chǎn)中用懸浮培養(yǎng)的模式在應(yīng)用。目前人們?yōu)檫m應(yīng)特定工業(yè)化的需要，通過(guò)改變細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和生活環(huán)境，對(duì)工程細(xì)胞進(jìn)行貼壁―懸浮的馴化。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)懸浮馴化可以轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)株［1－2］，或添加抗剪切保護(hù)劑進(jìn)行規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)。懸浮馴化過(guò)程中細(xì)胞易粘附聚集及結(jié)團(tuán)是目前貼壁細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)常見的問題［3－4］。由于動(dòng)物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)條件下對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基的要求十分嚴(yán)格，優(yōu)化BHK21細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)條件，使之達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，從而為體外規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 中農(nóng)威特生物科技服務(wù)有限公司研發(fā)部保存的BHK-21細(xì)胞，購(gòu)自ECACC，貨號(hào):84111301，來(lái)源:Hamster Syrian Kidney，產(chǎn)品編號(hào):05K029，代次:10代。培養(yǎng)基為自制的MEM+7%的胎牛血清，使用前按照產(chǎn)品說(shuō)明書配制。新生牛血清購(gòu)自蘭州榮曄生物技術(shù)有限責(zé)任公司。胰酶購(gòu)自HyClone公司。碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，德國(guó)INNOVATIS公司;滲透壓測(cè)定儀，上海醫(yī)科大學(xué)儀器;T25、T75培養(yǎng)瓶，1 000 ml三角培養(yǎng)瓶購(gòu)自Nunc公司;5 L生物反應(yīng)器，BELLCO生物反應(yīng)器，7.5 L生物反應(yīng)器，美國(guó)NBS公司。

1.3 方法

1.3.1 BHK-21細(xì)胞的懸浮馴化。取BHK21貼壁細(xì)胞種子，在T75培養(yǎng)瓶中加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，接種比例為1∶3，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層并生長(zhǎng)良好時(shí)，胰酶消化，用移液管輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，以0.75×106個(gè)/ml密度接種至1 000 ml三角培養(yǎng)瓶中，在37℃、100 r/min下先攪拌培養(yǎng)。并依此法連續(xù)傳代，直至40代，培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)每代細(xì)胞取樣計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 血清含量對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將已馴化的懸浮細(xì)胞種子傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，并以0.5×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種至5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中將GMEM培養(yǎng)基中的血清含量分別調(diào)整為1%、2%、5%、8%、15%和20%6個(gè)濃度進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)每代細(xì)胞取樣計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 培養(yǎng)液pH對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響。在其他培養(yǎng)條件一致的條件下，將GMEM培養(yǎng)液的pH分別設(shè)置為6.8～7.0、7.0 ～7.2、7.3 ～7.5 和 7.6 ～7.8，37 ℃ 培養(yǎng) 48 h 后，取樣計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 溶解氧對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響。培養(yǎng)條件同“1.3.3”，以不同轉(zhuǎn)速及通氣方式進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，第1種:80 r/min，1孔通氣;第 2種:80 r/min，2孔通氣;第 3種:120 r/min，2孔通氣。均在37℃培養(yǎng)48 h后，取樣計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 全自動(dòng)冰點(diǎn)滲透壓計(jì)測(cè)定滲透壓。①開機(jī)，待顯示溫度降至－9℃按“↑”鍵使測(cè)量探頭升起;②輕輕沖洗探頭，并加入0.5 mI樣品于樣品管中，套緊于測(cè)量探頭上，按“↑”測(cè)量開始;③約5 min測(cè)量探頭升起，得出測(cè)量結(jié)果;④記錄結(jié)果，取下樣品管，并按“↑”鍵使探頭回落，最后關(guān)機(jī)。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察及細(xì)胞數(shù)目和活力的測(cè)定。將取出的細(xì)胞懸浮液直接滴在載玻片上在顯微鏡下觀察;用細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，分析細(xì)胞活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHK21細(xì)胞懸浮馴化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞結(jié)團(tuán)的研究

2.1.1 BHK21細(xì)胞懸浮馴化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)變化的比較。BHK21細(xì)胞在GMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)形態(tài)的變化圖1。在培養(yǎng)初期(圖1a、1b)，大多數(shù)細(xì)胞散在分布，單個(gè)細(xì)胞透亮，邊緣光滑，部分細(xì)胞呈花生狀分布;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸相互粘附，2～3個(gè)細(xì)胞或更多聚集在一起(圖1c、1d)，細(xì)胞結(jié)團(tuán)越為明顯，更多的細(xì)胞粘連，團(tuán)塊變大，但很松散，輕輕吹打細(xì)胞，結(jié)團(tuán)即消失，此時(shí)結(jié)團(tuán)的細(xì)胞在鏡下觀察仍很透亮，活性好;由于細(xì)胞結(jié)團(tuán)給物質(zhì)的傳遞帶來(lái)極為不利的影響，在細(xì)胞培養(yǎng)11 d后(圖1e)，細(xì)胞邊緣不光滑，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞結(jié)團(tuán)越來(lái)越致密，團(tuán)塊內(nèi)細(xì)胞已無(wú)明顯輪廓界限，不能吹散;在培養(yǎng)后期(圖1f)，大量細(xì)胞開始死亡，結(jié)團(tuán)逐漸消失。

圖1 BHK21細(xì)胞懸浮馴化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化

2.1.2 BHK21細(xì)胞馴化培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞結(jié)團(tuán)對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。由表1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化，細(xì)胞結(jié)團(tuán)平均粒徑、細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和平均比生長(zhǎng)速率受到一定的影響。在培養(yǎng)初期，細(xì)胞結(jié)團(tuán)的平均粒徑較小，在12.81～15.78μm，細(xì)胞活性最高，從比生長(zhǎng)速率反映出細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝旺盛;在培養(yǎng)至第8天，隨著細(xì)胞結(jié)團(tuán)數(shù)量的增多，結(jié)團(tuán)平均粒徑增加，細(xì)胞繼續(xù)保持指數(shù)生長(zhǎng)期，平均比生長(zhǎng)速率達(dá)到了最大值2.93，細(xì)胞活性在94%左右，此時(shí)結(jié)團(tuán)的細(xì)胞在鏡下觀察更加透亮，活性更高;當(dāng)培養(yǎng)至第11天，結(jié)團(tuán)平均粒徑不再增加，細(xì)胞活性逐漸下降，比生長(zhǎng)速率降低，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩。主要是因?yàn)樵贐HK21細(xì)胞懸浮馴化生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞結(jié)團(tuán)過(guò)大，給物質(zhì)傳遞帶來(lái)較大的阻力，使得團(tuán)塊內(nèi)的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物耗竭和代謝副產(chǎn)物積累，細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響;在培養(yǎng)后期，細(xì)胞結(jié)團(tuán)松散，細(xì)胞活性迅速下降，細(xì)胞逐漸崩解。

因此，細(xì)胞的結(jié)團(tuán)嚴(yán)重影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)通過(guò)不同方法如調(diào)節(jié)Ca2+濃度，添加肝素、EDTA等物質(zhì)以避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)的出現(xiàn)。

表1 BHK21細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中結(jié)團(tuán)的平均粒徑與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的變化

2.2 接種濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響 BHK21細(xì)胞在不同接種濃度下培養(yǎng)(其他培養(yǎng)條件相同)，當(dāng)接種濃度過(guò)低，即低于0.2×106個(gè)/ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)增值明顯減緩，細(xì)胞濃度的倍增時(shí)間由24 h延長(zhǎng)至48 h或更多;若接種濃度過(guò)高，即1.0×106個(gè)/ml時(shí)，在培養(yǎng)期間細(xì)胞培養(yǎng)液的pH下降較快，不利于BHK21細(xì)胞的生存，因而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增速率降低。

2.3 血清含量對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 BHK21細(xì)胞在不同血清濃度的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)(其他培養(yǎng)條件相同)，含15%和20%高濃度血清的培養(yǎng)液可使細(xì)胞懸浮傳代24 h后，培養(yǎng)液的pH快速下降，可低至6.5～6.8，顯微鏡下觀察，上清液中可見較多雜質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)一般，胞內(nèi)有顆粒狀物質(zhì)。為了避免細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)換液;當(dāng)血清濃度較低時(shí)(1%、2%)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞終密度明顯低于其他組;血清濃度為5%、8%時(shí)，懸浮培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)較好，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。因此，綜合細(xì)胞及生產(chǎn)成本考慮，牛血清的最佳含量為5%。

2.4 培養(yǎng)液p H對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響 當(dāng)pH7.0～7.2時(shí)，培養(yǎng)液的pH下降較快，細(xì)胞生長(zhǎng)快，細(xì)胞密度比同期其他試驗(yàn)組高，細(xì)胞活性也較好。當(dāng)BHK21細(xì)胞培養(yǎng)液pH在7.4或6.8時(shí)，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞密度顯著低于其他試驗(yàn)組。所以BHK21細(xì)胞培養(yǎng)液理想的pH為7.0～7.2。

2.5 溶解氧對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的影響 該試驗(yàn)中所用的5 L生物反應(yīng)器有2個(gè)通氣孔，一孔可與空氣過(guò)濾器相連，另一孔不用時(shí)用螺帽封口，通氣時(shí)用滅菌的外有牛皮紙包被的多層紗布扎口即可。不同方式培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果見表2，由表2可知，在2孔通氣的方式80 r/min培養(yǎng)，細(xì)胞團(tuán)塊較多，細(xì)胞貼覆在罐壁和罐底的情況較多，而采用2孔通氣的100 r/min有利于BHK21細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表2 不同轉(zhuǎn)速與通氣量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

(1)在貼壁細(xì)胞懸浮馴化培養(yǎng)中，細(xì)胞聚集成團(tuán)是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的最大障礙。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不好時(shí)，細(xì)胞團(tuán)塊直徑可達(dá)數(shù)毫米，粘附的細(xì)胞數(shù)目達(dá)103個(gè)以上。由于細(xì)胞的成團(tuán)聚集給物質(zhì)傳遞帶來(lái)的巨大阻力，使得陷于細(xì)胞團(tuán)中央的細(xì)胞得不到充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，細(xì)胞活性和生長(zhǎng)速率逐漸降低，細(xì)胞開始凋亡。隨著細(xì)胞粘附基質(zhì)的改變，凋亡發(fā)生率增加，從而引起細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)改變等一系列問題，使得細(xì)胞表達(dá)能力下降［5］?？梢?，細(xì)胞結(jié)團(tuán)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)具有嚴(yán)重的影響，其影響程度的大小取決于細(xì)胞團(tuán)塊的疏松度和細(xì)胞結(jié)團(tuán)的平均粒徑大小。在該試驗(yàn)中，BHK21細(xì)胞培養(yǎng)初期，細(xì)胞的結(jié)團(tuán)粒徑逐漸增加，而細(xì)胞活性一直較高，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)團(tuán)平均粒徑達(dá)到最大值后不再增加，且越來(lái)越致密，而細(xì)胞活性下降，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，團(tuán)塊逐漸散開，最后細(xì)胞死亡。因此，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)研究中，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞結(jié)團(tuán)尺寸的大小或消除細(xì)胞結(jié)團(tuán)可提高細(xì)胞活性和培養(yǎng)密度，能改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，最終提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量。

(2)懸浮培養(yǎng)馴化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞接種濃度過(guò)低時(shí)，由于細(xì)胞間的相互作用及所分泌的各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子降低，使得細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;當(dāng)細(xì)胞接種濃度過(guò)高時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速消耗及代謝副產(chǎn)物積累較多等原因，使得細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，比生長(zhǎng)速率低于正常值。

(3)血清的質(zhì)量和濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有直接的影響［6］。一般透明、淡黃色，加熱滅活后顏色較深，蛋白沉淀少為優(yōu)良的血清。在細(xì)胞培養(yǎng)中，所用血清應(yīng)進(jìn)行無(wú)支原體和病毒污染以及無(wú)其他微生物污染的檢測(cè)，及細(xì)胞生物學(xué)方面的檢測(cè)。將所用的血清連續(xù)傳代3次以上培養(yǎng)細(xì)胞，確定它是否適宜該細(xì)胞系的長(zhǎng)期生長(zhǎng)［7］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，血清濃度越高，細(xì)胞分化速度越快，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，隨著細(xì)胞代謝物的增多及其血清中一些抑制因子作用的加強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)也受到影響。目前由于血清來(lái)源不穩(wěn)定且價(jià)格昂貴、作用機(jī)制不明確及實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難等一系列原因，使得開發(fā)出經(jīng)濟(jì)適用的血清替代品和無(wú)血清培養(yǎng)基成為亟待解決的難題。

(4)大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，影響培養(yǎng)液pH穩(wěn)定性的主要因素有:①緩沖液的緩沖能力及種類;②對(duì)流空間大小;③葡萄糖濃度。培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)。它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pKa為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對(duì)流空間加入CO2以防止其丟失及增加羥基離子。也有人使用磷酸緩沖液，但有資料報(bào)道磷酸對(duì)動(dòng)物細(xì)胞有毒害作用。該試驗(yàn)未做該方面的嘗試。另外HEPES生物緩沖劑也可加入NaHCO3/CO2系統(tǒng)，其 pKa為7.0，其緩沖能力為 pH 6.8 ～7.2。但當(dāng) HEPES 濃度高于25 mmol/L時(shí)，他對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞也有毒害作用。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝副產(chǎn)物積累使得培養(yǎng)液的pH下降較快，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。通常，大多數(shù)細(xì)胞的最適生長(zhǎng)環(huán)境pH在7.0左右，當(dāng)pH下降至6.8時(shí)，會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此必須對(duì)PH進(jìn)行調(diào)控，使培養(yǎng)過(guò)程中pH不能下降至6.8以下。

(5)在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，如何提供足夠的氧非常重要［8］。同期攪拌的目的主要有:①提供細(xì)胞代謝所需的足夠氧氣;②使培養(yǎng)液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過(guò)程。對(duì)于一定的設(shè)備而言，增大攪拌速度、攪拌功率和通氣量都能提高溶氧水平，但三者之間相互關(guān)聯(lián)。

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