王俊峰，尹 堯，陳玉花，加春生，王曉楠

(1.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150088;2.哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱150025)

近年來，隨著抗生素制藥工業(yè)的快速發(fā)展，抗生素工業(yè)廢水已成為嚴(yán)重危害人類健康和生態(tài)環(huán)境平衡的棘手問題，對抗生素制藥工業(yè)廢水進行有效處理已經(jīng)刻不容緩，成為制約社會可持續(xù)發(fā)展的緊要問題［1］。抗生素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的發(fā)酵液、酸廢水、堿廢水和有機溶劑廢水等。其具有有機物濃度高、存在生物毒性物質(zhì)、色度高、氣味重、pH波動大等特征［2］。目前，抗生素制約工業(yè)廢水處理方法主要有化學(xué)處理法、物化處理法(包括混凝－沉淀法、反滲透－膜分離法、吸附法、光降解法、包埋法及電解法等)、生物處理法以及多種方法復(fù)合處理等。其中生物處理方法具有處理條件較為溫和、微生物適應(yīng)性較強、費用低廉、較易培養(yǎng)等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗生素制藥工業(yè)廢水的處理［3］。筆者試圖從抗生素廢水處理的活性污泥中篩選出具有高效降解能力的菌株，并研究其生物降解特性，應(yīng)用于實際生產(chǎn)，以期為抗生素類工業(yè)廢水高效處理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 水樣 試驗水樣取自哈爾濱某制藥企業(yè)廢水排放口，活性污泥取自曝氣池的回流污泥。

1.2 培養(yǎng) 基 ①無機鹽培養(yǎng)基:KH2PO40.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 6.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO40.4 g/L，微量元素1 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。②LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為1.5%。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效降解菌株的分離篩選。(1)增殖培養(yǎng):取2 ml活性污泥沉淀的上清液，接種到裝液量200 ml的三角瓶中，于30℃、100 r/min下培養(yǎng)48 h，而后進行瓊脂平板劃線分離，分離得到的單菌落經(jīng)多次反復(fù)分離、純化后得到純菌株［4］。

(2)菌株篩選:將分離純化得到的菌落特征較典型、性狀較優(yōu)良的純菌株分別接種到含50%廢水的無機鹽培養(yǎng)基中，于30℃、100 r/min條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌體的生長情況和對COD的去除率，篩選出降解率高的優(yōu)勢菌株［5－6］。

1.3.2 菌株的鑒定。(1)形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特征鑒定。對純培養(yǎng)菌株的菌落特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征進行觀察與鑒定，同時采用透射電鏡進行觀察［7］。

(2)16SrDNA序列分析法鑒定。以細(xì)菌總DNA為模板，選取一對細(xì)菌通用引物進行擴增，其核酸序列如下:引物BSF8/20:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(E.coli16s rDNA對應(yīng)位點為8～27);引物BSR154120:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(E.coli的16s rDNA對應(yīng)位點為1541～1522)。PCR反應(yīng)條件:94℃變性1min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，在此條件下進行30個循環(huán)，然后在72℃下保溫10 min，測序由大連寶生物工程有限公司完成。將菌株NG3 16s rDNA核酸序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行比對分析(http://ncbi.nlm.nih.govlast)，由 Gen-Bank中得到相關(guān)菌株的序列，與該研究所測的序列一起輸入Clustalx1.8程序進行DNA同源性序列分析［8］。

1.3.3 生物量與COD測定。生物量用光密度OD600表示，COD的測定用重鉻酸鉀法［9］。

1.3.4 NG3菌株的生長及降解特性。采用正交試驗法研究高效降解菌NG3菌株的生長及降解特性［10］。其正交試驗的因素與水平見表1。

表1 NG3菌株正交試驗的因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)、培養(yǎng)及部分生理生化鑒定結(jié)果 NG3菌株為革蘭氏陰性菌，好氧，菌體呈桿狀，無芽胞，無鞭毛(圖1)，菌落呈乳白色，菌落邊緣整齊，微凸起，表面及邊緣較光滑，黏稠易挑起(圖2)，其生理生化特征見表2。

圖1 NG3菌株電鏡照片

圖2 NG3菌株菌落照片

表2 NG3菌株的生理生化特征

2.2 降解菌NG3的16Sr DNA基因PCR擴增和序列分析

2.2.1 PCR擴增和測序結(jié)果。以NG3菌株總DNA為模板，用16SrDNA的通用引物進行PCR擴增，得到1條約1.5 kb的片段(圖3)。擴增片段經(jīng)回收、測序，明確該片段大小為1 475 bp。

2.2.2 NG3菌株核酸序列同源性比較。將 NG3菌株16SrDNA測序結(jié)果輸入GenBank中，利用Blast軟件進行序列同源性分析，結(jié)果表明，NG3與Acinetobacter(不動桿菌屬)的大多數(shù)菌種的相似度達到95%以上，其中NG3與菌種Acinetobacter sp.C65的16SrDNA序列相似度達到99%。

圖3 16Sr DNA引物PCR擴增結(jié)果

2.3 Acinetobacter sp.NG3菌株的生長及降解特性 Acinetobacter sp.NG3菌株正交試驗結(jié)果見表3。

表3 NG3菌株正交試驗結(jié)果

由表3可知，Acinetobacter sp.NG3菌株對溫度較為敏感，直接影響其抗生素的降解效率，各因素對有機物COD去除率的影響順序為溫度＞搖床轉(zhuǎn)速＞pH;Acinetobacter sp.NG3菌株最佳降解條件是:溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH為7.0。

3 結(jié)論

該試驗通過選擇性富集培養(yǎng)，從高濃度抗生素制藥工業(yè)廢水處理的活性污泥中篩選得到一株具有較高抗生素降解能力的優(yōu)勢降解菌NG3，經(jīng)染色觀察、形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征鑒定和16SrDNA序列分析，最終確定NG3菌株為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)。進一步的降解研究表明，Acinetobacter sp.NG3菌株的降解作用受溫度影響較敏感，可能是溫度影響NG3菌分泌的降解抗生素的代謝酶的活性，其次是轉(zhuǎn)速，通過搖瓶發(fā)酵試驗表明，轉(zhuǎn)速大小直接影響氧氣的供應(yīng)，pH影響最小。最終確定其最佳降解條件為:溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH為7.0。Acineto-bacter sp.NG3菌株是從自然環(huán)境中篩選獲得的野生型菌株，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后其COD去除率達到89.5%，作為工業(yè)化大規(guī)模處理抗生素制藥廢水并不一定理想，但可作為出發(fā)菌株，通過人工誘變育種的方法篩選COD去除率較高的優(yōu)勢菌株;也可以對其進行基因克隆，利用基因工程的方法構(gòu)建工程菌，以適合大規(guī)模工業(yè)化進行抗生素制藥廢水處理的需要。

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