王群林，李巖，許聰，卞偉華，張小華*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東煙臺264003;2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科，山東濱州256603;3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺264003)

納米氧化鋅為一種新型無機多功能材料，是粒徑介于1～100 nm的金屬氧化物微粒［1］。由于納米氧化鋅具有特殊優(yōu)異的性能［2］，使其在許多研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值和廣闊應(yīng)用前景。目前，納米氧化鋅已被廣泛應(yīng)用于紡織［3］、化妝品［4］和醫(yī)藥等領(lǐng)域，不可避免地進入自然環(huán)境和生命體中［5－6］，但其安全性一直廣受爭議。研究表明，納米材料對人類身體健康和周圍生態(tài)系統(tǒng)可能造成潛在危害，隨著納米毒理學(xué)的興起和發(fā)展，納米氧化鋅的生物安全性被相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者關(guān)注［7］。筆者利用小鼠腹腔注射納米氧化鋅，通過觀察小鼠一般狀況(存活率、體重)和肺濕干質(zhì)量比，觀察小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變，檢測支氣管肺泡灌洗液及血清中ICAM-1和TNF-α含量變化，以探索納米氧化鋅對小鼠肺毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康昆明小鼠，6～8周齡，體重(25±2)g，雌雄各半，購自煙臺綠葉制藥有限公司。

1.2 試驗試劑 納米氧化鋅，購自 Sigma公司(貨號96479)，臨用前配制濃度83 mg/ml懸濁液;生理鹽水，購自濱州醫(yī)學(xué)院;細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的ELISA試劑盒，購自上海太陽生物技術(shù)有限公司;其他試劑，均為分析純，購自商業(yè)試劑公司。

1.3 動物分組及處理 取25 g左右健康昆明小鼠22只，將其隨機分為空白對照組和試驗組，并用電子秤稱取各小鼠試驗前體重。飼養(yǎng)3 d后，給予試驗組小鼠腹腔注射0.15 ml已配制納米ZnO懸濁液?？瞻讓φ战M注射0.15 ml生理鹽水。連續(xù)注射7 d。

1.4 小鼠一般情況觀察 觀察包括生存狀態(tài)、生存率和體重改變，注射7 d后繼續(xù)飼養(yǎng)3 d，然后抓取小鼠稱重并麻醉、解剖和取材。

1.5 肺組織病理切片HE染色 各組小鼠腹腔注射生理鹽水或納米ZnO懸濁液后3 d，眼球取血并處死小鼠，開胸取右肺上葉，修剪為小塊，迅速固定于4%甲醛溶液中，72 h后進行石蠟切片及常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6 肺組織濕/干質(zhì)量(W/D)比值 每組小鼠處死后，取全肺，稱濕重，然后將小鼠肺置于60℃恒溫箱中干燥，72 h后取出稱干重，計算肺W/D比值。

1.7 血液及灌洗液炎癥因子檢測 采用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液及血清中細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。小鼠眼球取血，靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，上清凍存待檢。解剖頸部和胸部，氣管和右側(cè)肺葉結(jié)扎，左側(cè)肺部灌洗，用穿刺針插入氣管上端，0.5 ml生理鹽水(NS)反復(fù)沖洗3遍，3 000 r/min離心10 min，取上清凍存待檢。按照ELISA試劑盒說明書(上海太陽生物技術(shù)有限公司)操作，每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般生存狀況觀察和存活率比較 觀察試驗過程中對照組小鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，攝食、飲水無明顯異常，毛發(fā)光亮，反應(yīng)靈敏;注射納米氧化鋅試驗組小鼠出現(xiàn)精神不佳，蜷縮成團，攝食、飲水減少，反應(yīng)遲鈍，活動減少。與正常對照組相比，試驗組小鼠存活率降低(表1)。

表1 ZnO納米顆粒處理對小鼠存活率的影響

由表2可知，與試驗前相比，10 d后正常組小鼠平均體重增加10 g左右，試驗組小鼠體重增加僅不到2 g。通過比較小鼠生存狀況、體重以及存活率狀況，考慮試驗組小鼠是由于氧化鋅納米粒子對小鼠機體有損傷作用，為納米氧化鋅對機體產(chǎn)生不良反應(yīng)提供試驗依據(jù)。

表2 ZnO納米顆粒處理對小鼠體重的影響 g

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)觀察 從圖1可以看出，光鏡下對照組可見肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡內(nèi)充滿氣體，少有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁較薄，無明顯間質(zhì)增生;與對照組相比，試驗組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，間質(zhì)明顯增生。據(jù)此推測，氧化鋅納米顆粒對小鼠肺組織有損傷，可刺激肺組織產(chǎn)生炎癥性改變，影響肺組織結(jié)構(gòu)。

圖1 ZnO納米顆粒處理小鼠肺組織的病理學(xué)觀察

2.3 小鼠肺W/D比值 由表3可知，試驗組小鼠肺組織W/D比值明顯高于對照組(P＜0.05)。

表3 各組小鼠肺W/D比值的比較(ˉx±s)

2.4 小鼠血清及肺泡灌洗液炎癥因子檢測結(jié)果 由表4可知，與對照組相比，試驗組小鼠血清及肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-ɑ及ICAM-1含量明顯升高，差異達顯著水平(P＜0.05)。這表明氧化鋅納米粒子可以刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促使炎癥因子分泌明顯增加。

表4 納米氧化鋅顆粒對小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α和ICAM-1含量的影響(±s，n=9) μg/L

表4 納米氧化鋅顆粒對小鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α和ICAM-1含量的影響(±s，n=9) μg/L

注:*表示與對照組差異顯著(P＜0.05)。

組別 血清TNF-α 灌洗液TNF-α 血清ICAM-1 灌洗液ICAM-1對照組132.3 ±10.7 100.5 ±17.2 12.3 ±4.7 14.5 ±2.2試驗組 228.8 ±15.6* 200.3 ±4.1* 19.4 ±3.7* 19.9 ±3.4*

3 結(jié)論與討論

納米氧化鋅可以通過口服、吸入、注射或者皮膚滲透等途徑進入人體，對人體的各個系統(tǒng)產(chǎn)生影響。據(jù)報道，納米氧化鋅顆?？蓪θ梭w正常細(xì)胞有毒性作用，如可損傷單核細(xì)胞系、肺腺癌細(xì)胞系、肺成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等［8－10］。吳誠等［11］采用孫氏改良寇氏法誘發(fā)小鼠急性毒試驗，配制6個梯度的納米氧化鋅藥液以灌胃方式一次性供給試鼠。結(jié)果表明，高劑量納米氧化鋅可對小鼠的腎臟、小腸、肺臟和肝臟等組織器官造成廣泛性損傷，并引起嚴(yán)重的瘀血、出血、細(xì)胞變性壞死、大量細(xì)胞核固縮碎裂等病理變化。Liu等［12］報道3種納米材料(氧化鋅、銀、二氧化鈦)氣管灌注大鼠后均可引起肺部氧化應(yīng)激損傷。筆者利用納米氧化鋅腹腔內(nèi)注射小鼠，初步探討納米氧化鋅顆粒對小鼠肺組織及炎癥介質(zhì)的影響。結(jié)果表明，對照組相比，注射納米氧化鋅小鼠生存狀態(tài)變差、存活率降低、體重減輕，肺的濕干比增高，肺組織出現(xiàn)一定程度損傷，血清、肺泡灌洗液中TNF-α及ICAM-1含量明顯升高。綜上所述，納米氧化鋅對小鼠產(chǎn)生一定毒性作用，導(dǎo)致小鼠生存狀態(tài)、肺組織形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，同時納米氧化鋅可刺激小鼠機體產(chǎn)生炎性反應(yīng)，促使炎癥因子TNF-α及ICAM-1含量明顯升高。納米氧化鋅通過如何機制導(dǎo)致肺損傷是今后進一步研究方向。

［1］DU Y，ZANG M S，HONG J，et al.Structural and optical properties of nanophase zinc oxide［J］.Applied Physics A，2003，76:171 －176.

［2］趙玉嶺.納米材料性質(zhì)及應(yīng)用［J］.煤炭科技，2009，28(8):149 －151.

［3］周少余，徐水凌，朱逢佳，等.納米氧化鋅海絲纖維的抗菌和細(xì)胞毒性作用［J］.上海紡織科技，2009，37(12):5 －7.

［4］呂瑛，謝嘉穎.防曬劑中納米氧化鋅的安全性研究進展［J］.中國化妝品(行業(yè)版)，2011(5):62 －65.

［5］王發(fā)園.人工納米顆粒的植物毒性及其在植物中的吸收和累積［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2012，7(2):140 －147.

［6］朱小山，朱琳，田勝艷，等.三種金屬氧化物納米顆粒的水生態(tài)毒性［J］.生態(tài)學(xué)報，2008，28(8):3507 －3516.

［7］宋文華，張金洋，高敏苓，等.納米氧化鋅對小鼠的急性毒性效應(yīng)研究［C］//2008年全國納米生物和醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集.中國納米技術(shù)學(xué)會，江蘇省生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會，中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會，2008:196－198.

［8］劉佳蕙，楊勝韜，王海芳，等.納米氧化鋅對人單核細(xì)胞系U937的毒性及其機制研究［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44(9):790 －794.

［9］王琳，王莉娟，張芳，等.納米氧化鋅對人肺腺癌細(xì)胞A549的毒性［J］.中國科學(xué)院研究生院學(xué)報，2009，26(1):83－90.

［10］劉鵬鵬，關(guān)榮發(fā)，程歌，等.納米氧化鋅對人正常肝細(xì)胞HL－7702的毒性作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(36):18023 －18026.

［11］吳誠，文利新，袁慧，等.納米氧化鋅對小鼠的毒性試驗［J］.糧食與飼料工業(yè)，2008(5):38－39.

［12］LIU H，YANG D，YANG H，et al.Comparative study of respiratory tract immune toxicity induced by three sterilisation nanoparticles:silver，zinc oxide and titanium dioxide［J］.JHazard Mater，2013，248/249:478－486.