高瑀瓏 鄭 銳 王玉梅 王立峰 鞠興榮 袁 建

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，南京 210023)

菜籽分離蛋白分子質(zhì)量分布及酶解條件的研究

高瑀瓏 鄭 銳 王玉梅 王立峰 鞠興榮 袁 建

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，南京 210023)

以脫脂“雙低”油菜籽為原料，利用堿溶解酸沉淀法提取菜籽分離蛋白；用SDS-PAGE凝膠電泳研究菜籽蛋白的分子質(zhì)量的組成；以水解度和氮回收率為考察指標(biāo)，用響應(yīng)面分析法擬合了Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白成菜籽肽的二次多項數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了酶解菜籽分離蛋白的工藝參數(shù)。SDS-PAGE凝膠電泳研究表明利用堿溶解酸沉淀提取的菜籽分離蛋白主要是2S清蛋白。響應(yīng)面分析法研究的試驗結(jié)果表明，酶的使用量、pH、酶解溫度、酶的使用量與pH的交互作用對Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白的水解度和氮回收率的影響均顯著(P<0.05)。通過求解菜籽肽的二次多項數(shù)學(xué)模型的逆矩陣方程，可得Alcalase 2.4L水解菜籽分離蛋白的最佳條件為：酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解溫度54 ℃；在此酶解條件下，菜籽分離蛋白濃度為5%時，水解5 h，所得的水解度和氮回收率分別為35.12%及52.96%。

菜籽分離蛋白 SDS-PAGE電泳 酶解 水解度 氮回收率 響應(yīng)面法

過去人們一直認(rèn)為機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收是以單個氨基酸的方式進(jìn)行的。目前研究表明許多小分子的肽也能夠直接被機(jī)體吸收和利用，并發(fā)揮重要的生理功能。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白多肽在治療人類疾病方面具有多種生物功能，如抑菌性，免疫調(diào)節(jié)活性，抗氧化、抗血栓、降血脂、降低膽固醇含量等生理活性[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，以菜籽蛋白為原料通過酶解得到的菜籽肽，其加工特性如溶解性、乳化性、持水性等明顯優(yōu)于菜籽蛋白[4-5]；同時也發(fā)現(xiàn)其中的一些小分子的菜籽肽不僅吸收快、耗能低、吸收率高，還具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤和促進(jìn)動物細(xì)胞生長等生物活性[6]。

國內(nèi)外學(xué)者利用不同的水解酶對菜籽蛋白酶解來制備菜籽肽，并對其加工特性及生物活性進(jìn)行了研究，結(jié)果證實了Alcalase酶的酶解產(chǎn)物具有較好的加工功能及生物活性。黃亮等[7]以菜籽蛋白為原料，水解度為衡量指標(biāo)，對酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解作用進(jìn)行對比分析，最終確定Alcalase酶的酶解效果較好，使菜籽分離蛋白水解度可達(dá)32.19%。He等[8]研究了Alcalase 2.4L蛋白酶、K蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶和嗜熱菌蛋白酶酶解菜籽蛋白的產(chǎn)物菜籽肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)Alcalase 2.4L和K蛋白酶的酶解產(chǎn)物菜籽肽的抗氧化性效果較好。Makinen等[9]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶對菜籽粕進(jìn)行酶解，結(jié)果表明Alcalase 2.4L水解物具有最高的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性及抑制脂肪氧化活性。

菜籽蛋白組分較復(fù)雜，本研究以脫脂“雙低”油菜籽為原料，用堿溶解結(jié)合酸沉淀的方法來獲得混合菜籽分離蛋白，利用SDS-PAGE凝膠電泳法對混合菜籽分離蛋白的分子質(zhì)量的分布進(jìn)行了分析，然后再對此混合菜籽分離蛋白的Alcalase 2.4L酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。國內(nèi)外很少有文獻(xiàn)用堿溶解結(jié)合酸沉淀的方法對混合菜籽分離蛋白的分子質(zhì)量分布進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，一些文獻(xiàn)僅報道了從菜籽粕中提取并分離出幾種蛋白[10-12]，同時，許多研究也僅以單一指標(biāo)(水解度或肽得率)為響應(yīng)值來優(yōu)化菜籽肽的制備條件，不能全面的反映菜籽蛋白的酶解效果[10,13]。本研究以Alcalase 2.4L酶的使用量、pH值及酶解溫度作為影響因素，Alcalase 2.4L水解物的水解度和氮回收率2個指標(biāo)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化菜籽肽的制備，為進(jìn)一步開發(fā)和利用菜籽肽提供了條件和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(lán)型“雙低”油菜籽寧雜21號：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(11 ku-245 ku)：北京天根生化科技有限公司；Alcalase 2.4L：諾維信公司；N,N-甲叉雙丙烯胺(Bis)：美國Bio-RAD公司；Tris、過硫酸銨、SDS、TEMED：sigma公司；丙烯酰胺(Acr)、甘氨酸(Gly)、考馬斯亮藍(lán)R-250、溴酚藍(lán)和β-巰基乙醇：美國Amresco公司；石油醚、無水乙醇、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、濃硫酸和濃鹽酸等均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JFSD-70實驗室粉碎磨：上海市嘉定糧油檢測儀器廠；SXT-8索氏抽提裝置：南京晚晴化玻儀器有限公司；J6HC冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司； Milli-Q純水機(jī)：美國Merck Millipore公司；KjelFlex K-360 凱氏定氮儀：瑞士Buchi公司；GM-0.33A隔膜真空泵、FD-JH-JS-1000 mL玻璃砂芯過濾裝置：天津津騰實驗設(shè)備有限公司；FreeZone 6L真空冷凍干燥機(jī)：美國LABCONCO公司；Mini-Protean Tetra C微型垂直電泳儀：美國Bio-RAD公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-2 恒溫磁力攪拌器：國華電器有限公司；TDL-5-A 低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C雷磁pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

“雙低”油菜籽去皮后，利用石油醚脫脂。將1 kg去皮油菜籽置于索氏抽提器中，處理72 h，待油脂抽提干凈后，置于通風(fēng)櫥干燥，粉碎，過100目篩，得脫脂菜籽粉備用。

1.3.2 菜籽蛋白測定

采用半微量凱氏定氮法[14]。

1.3.3 菜籽分離蛋白制取工藝

由于菜籽中存在硫甙、多酚和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其應(yīng)用受到了限制[15]。菜籽蛋白的制備參見文獻(xiàn)[4,16]的方法，并做適當(dāng)?shù)男薷?，以去除部分植酸及多酚類物質(zhì)。

具體方法：取適量菜籽粉→攪拌、浸提2 h (料液質(zhì)量體積比1∶20，25 ℃，pH 5，浸提2次，去植酸)→離心 (4 000 r/min,10 min)→收集沉淀→堿溶解 (料液比1∶20，25 ℃，pH 11，攪拌1 h)→ 離心 (4 000 r/min，10 min)→ 收集上清液→ 酸沉淀 (pH 4.5，30 min)→ 離心 (4 000 r/min,10 min)→ 收集沉淀→ 用95%乙醇清洗 (3次，去除單寧)→ 收集沉淀→ 冷凍干燥，研磨，過100目篩→菜籽蛋白。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的測定

1.3.4.1 SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑的配制

SDS-PAGE凝膠電泳凝膠的配制見表1。

表1 凝膠的配制

其他試劑：

1)2×樣品緩沖液(10 mL)：40%甘油2 mL，溴酚藍(lán)0.020 2 g，Tris-HCl (pH 6.8，1.0 mol/L)1 mL，β-巰基乙醇0.14 mL，10%SDS 4 mL，H2O 3 mL；

2)5×Tris-Gly Buffer (電極緩沖液，1 L)：0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L Glycine，0.5% SDS (Tris 15.1 g，Glycine 94 g，SDS 5 g，蒸餾水1 000 mL)；

3)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(200 mL)：0.2 g R-250，84 mL 95%乙醇，20 mL冰醋酸，加水定容至200 mL，濾紙過濾；

4)脫色液(1 L)：100 mL 甲醇，100 mL 冰醋酸，800 mL蒸餾水。

1.3.4.2 SDS-PAGE凝膠電泳

采用電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按照文獻(xiàn)[17]的方法，并作適當(dāng)?shù)男薷?。具體方法：將菜籽蛋白溶液(5 mg/mL)與樣品緩沖液按1∶1的體積比混合，100 ℃煮沸5～7 min，上樣10 μL，電壓為100 V，時間為2～3 h，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，染色時間30 min以內(nèi)，置于脫色液中脫色，過夜，待膠片背景藍(lán)色呈透明狀，拍照，觀察并分析菜籽蛋白的分子質(zhì)量分布。

1.3.5 菜籽蛋白的酶解

按照文獻(xiàn)[4]的方法，并作適當(dāng)修改。具體方法：將5%菜籽蛋白溶液置于50 ℃的水浴中，調(diào)整pH，加入適當(dāng)?shù)腁lcalase 2.4L酶解液，添加適量的NaOH使體系pH不變，5 h后，置于95 ℃水浴中處理10 min進(jìn)行滅酶，冷卻(pH調(diào)至4.5)，30 min后，離心(10 000 r/min，10 min，沉淀未酶解的大分子蛋白及不溶物)，收集上清液，調(diào)pH至7.0，經(jīng)0.45 μm微濾膜微濾，冷凍干燥后得菜籽粗肽。

1.3.6 水解度(Degree of hydrolysis,DH)的測定

采用pH-stat法[18]測菜籽蛋白水解度。DH為菜籽蛋白被水解的肽鍵的比例，DH計算按照式(1)。

(1)

式中：V為消耗NaOH的體積/mL；C為標(biāo)準(zhǔn)NaOH 的濃度/mol/L；mp為蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；htot為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，其取值為7.8 mmol/g；α為樣品分離蛋白氨基平均解離度，其取值為0.55。

1.3.7 氮回收率(Nitrogen recovery,NR)的測定

氮回收率的測定按照文獻(xiàn)[4]，并作適當(dāng)修改。具體方法：將酶解液置于95 ℃水浴中滅酶10 min，酶解液冷卻后pH調(diào)至4.5，30 min后，離心(10 000 r/min，10 min，沉淀未酶解的大分子蛋白及不溶物)，收集上清液，采用凱氏定氮儀測定上清液中蛋白含量。NR計算按照式(2)。

(2)

式中：M0為上清液蛋白質(zhì)含量/g；M1為酶解液開始反應(yīng)中蛋白質(zhì)含量/g。

1.3.8 單因素試驗

根據(jù)前期預(yù)研究試驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)影響菜籽分離蛋白酶解的主要因素有酶的使用量、pH值、酶解溫度，本研究考察了這3個主要因素對DH及NR的影響，酶的使用量采用0.012、0.024、0.036、0.048、0.06 Au/g 5個水平；pH值采用7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 5個水平；酶解溫度采用40、45、50、55、60 ℃ 5個水平。

1.3.9 酶解工藝響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法(RSM)進(jìn)行菜籽蛋白的Alcalase 2.4L酶解優(yōu)化試驗，獲得酶解過程中影響DH及NR的最佳工藝參數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.4軟件對試驗進(jìn)行設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽蛋白分子質(zhì)量分布

菜籽粕中的蛋白質(zhì)主要包括12S球蛋白和2S清蛋白，同時還含有一些較小的蛋白質(zhì)，如胰島素抑制劑、硫堇和轉(zhuǎn)脂蛋白[19]。12S的球蛋白平均分子質(zhì)量約為300 ku，在極端pH和尿素溶液中可完全離解成6個亞基，每個亞基有2條約30和20 ku的多肽鏈組成，多肽鏈間由二硫鍵連接；2S的清蛋白分子質(zhì)量在12.5和14.5 ku之間，其中有2個多肽鏈靠2個二硫鍵連接；小的多肽鏈分子質(zhì)量為4.5 ku，大的為10 ku[20]。SDS-PAGE具有分辨率高、重復(fù)性好、設(shè)備簡單、操作容易的特點，但SDS-PAGE不能求得每個蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其測定的是蛋白質(zhì)亞基或單肽鏈蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量[21]。

利用SDS-PAGE凝膠電泳分析菜籽分離蛋白的分子質(zhì)量組成見圖1。從圖1中看出共有11個條帶，3～8為12S球蛋白的多肽鏈條帶，10、11為2S清蛋白的多肽鏈條帶，1,2可能為12S球蛋白的亞基條帶，顏色較淺，發(fā)生了降解，9可能為未變性2S清蛋白條帶。SDS-PAGE凝膠電泳分析說明利用堿溶解酸沉淀所提取的菜籽分離蛋白的主要成分為2S清蛋白，2S清蛋白的含量大于12S菜籽谷蛋白。

注：1表示蛋白質(zhì)marker;2、3、4表示菜籽分離蛋白。圖1 菜籽分離蛋白凝膠電泳圖

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶的使用量對菜籽蛋白的水解度(DH)及氮回收率(NR)的影響

為了探明Alcalase 2.4L的使用量對菜籽蛋白的DH及NR的影響，所以固定酶促反應(yīng)的其他條件為：pH 8.0，酶解溫度50 ℃，底物濃度5%，酶解時間5 h。以DH及NR為測定指標(biāo)，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在水解反應(yīng)中，隨著Alcalase 2.4L酶使用量的增加，DH及NR會不斷增加。因隨著酶的使用量增加，其與底物結(jié)合的幾率增大，從而增加了菜籽蛋白的水解程度。當(dāng)酶量增加到飽和以后，水解度及氮回收率增加趨于平緩。在實際操作過程中，酶的使用量增加會提高生產(chǎn)成本，也不利于酶解過程的控制，因此從經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮，本研究選擇酶解反應(yīng)中酶的使用量為0.036～0.06 Au/g的范圍。

圖2 酶的使用量對水解度及氮回收率的影響

2.2.2 pH對菜籽蛋白的水解度及氮回收率的影響

為了明確單因素pH對DH及NR的影響，固定酶解反應(yīng)的其他條件為：酶的使用量0.048 Au/g，pH 8.0，酶解溫度50 ℃，底物濃度5%，酶解時間5 h，以DH及NR為測定指標(biāo)，結(jié)果見圖3。如圖3所示，隨著pH的增加，DH及NR均呈先升高后降低的趨勢，兩者在pH 9.0左右均達(dá)到最高值。一般情況下，一種酶僅在一個狹窄的pH值范圍內(nèi)具有最高活力，即酶的最適pH值。pH值能夠改變底物的解離狀態(tài)，影響底物與酶的結(jié)合。過酸或過堿會改變酶的空間構(gòu)象，引起酶與底物結(jié)合受阻，進(jìn)而導(dǎo)致酶失活。本研究酶解反應(yīng)中pH的取值范圍選擇8.5～9.5。

圖3 pH對水解度及氮回收率的影響

2.2.3 酶解溫度對菜籽蛋白的水解度及氮回收率的影響

為了確定酶解溫度對DH及NR的影響，所以固定酶促反應(yīng)的其它條件為，酶的使用量 0.048 Au/g，pH 9.0，底物濃度5%，酶解時間5 h，以DH和NR為測定指標(biāo)，結(jié)果見圖4。隨著酶解溫度的升高，DH及NR值先升高后降低，兩者在50 ℃左右均達(dá)到最大。酶促反應(yīng)有最適溫度，一般隨著溫度的升高反應(yīng)物分子間接觸的頻率增加，酶促反應(yīng)加快；當(dāng)溫度上升到一定程度，酶分子吸收能量過多，引起維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解體，導(dǎo)致酶蛋白變性，從而使酶活性減弱或喪失。從圖4中可以看出Alcalase 2.4L作用的溫度范圍較寬，在45～55 ℃都具有較強(qiáng)的活性。

圖4 酶解溫度對水解度及氮回收率的影響

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解條件結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面分析法因素、水平的選取及試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[22]，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶的使用量(A)、pH值(B)、酶解溫度(C)3個關(guān)鍵因素為自變量，試驗的因素、水平及其編碼的選取值見表2；DH及NR2指標(biāo)為響應(yīng)值(Y)，利用Design-Expert軟件，本研究的三因素三水平共17個試驗組的試驗設(shè)計及其結(jié)果見表2。

2.3.2 回歸方程的擬合及方差分析

通過Design-Expert軟件對響應(yīng)值與各因素的編碼值進(jìn)行回歸擬合，得到DH及NR對3個因素的回歸擬合方程分別為式(3)和式(4)：

Y(DH)=33.43+2.59×A+1.67×B+2.46×C+1.60×A×B-0.16×A×C+0.13×B×C-2.61×A2-2.48×B2-1.89×C2

(3)

Y(NR)= 51.89+0.48×A-0.96×B+1.01×C+0.47×A×B+0.20×A×C-0.090×B×C-0.90×A2-1.96×B2-0.38×C2

(4)

表3為模型、各個因素及其交互作用的回歸方差分析，由表3可知，試驗所選用的二次多項模型極顯著(P(DH)=0.000 2，P(NR)<0.000 1)，P值越小，其越顯著；失擬項在P= 0.05水平上不顯著(P(DH)=0.114 2 >0.05，P(NR)=0.666 2>0.05)，說明模型的各個處理間差異顯著，而模型的計算結(jié)果與檢驗結(jié)果間差異不顯著，模型選擇合理。DH及NR的校正決定系數(shù)(Radj2)分別為0.931 1和0.971 4，表明模型擬合程度好，試驗誤差小，可用模型來分析和預(yù)測Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白的水解度和氮回收率。DH僅約有6.9%，NR僅約有2.9%的總變異不能由各自擬合的模型來解釋。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及其結(jié)果

注：A為酶的使用量；B為pH值；C為酶解溫度；表中a表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

表3 回歸方程的方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗

注：DH為菜籽蛋白的水解度；NR為菜籽蛋白的氮回收率。

各影響因子酶的使用量(A)、pH(B)、酶解溫度 (C)及其交互作用的方差分析表明：A、B、C、A2、B2對DH與NR影響極顯著，說明酶解過程中，A、B、C對DH與NR均有顯著影響；AB對DH與NR影響也比較顯著。

2.3.3 Alcalase 2.4L的酶解制備菜籽肽的響應(yīng)面分析

擬合模型的響應(yīng)面圖可比較直觀地解釋各變量和變量之間對響應(yīng)值的影響。將建立的回歸擬合模型中任一因素固定在零水平，得到另外兩因素的交互影響，以DH及NR為響應(yīng)值的二次回歸方程的響應(yīng)面，分別見圖5、圖6。

從圖5和圖6可以看出，酶的使用量、pH、酶解溫度對酶解過程中的水解度和氮回收率影響都極顯著。圖5a中，隨著酶的使用量和pH的增加，DH逐漸增加，但pH從9.1增加到9.5時，DH逐漸降低，可能是堿性過強(qiáng)導(dǎo)致酶失活；圖5b中，隨著酶的使用量和酶解溫度的增加，DH增加趨勢明顯，說明酶的使用量和酶解溫度對DH的增加具有促進(jìn)作用；圖5c中，酶解溫度的增加利于水解的進(jìn)行，而pH在上升到一定值后，pH的繼續(xù)增加會導(dǎo)致DH值的降低。圖6a中，酶使用量的增加有助于NR值的增加；在一定的pH范圍內(nèi)，NR值隨pH的升高而升高，pH達(dá)到9.0后，隨著pH的增加，NR值快速下降；圖6b中，酶的使用量、酶解溫度與NR值呈正相關(guān)，酶量和酶解溫度的增加均有利于氮的回收；圖6c中，pH和酶解溫度對NR的影響趨勢相對平緩，二者的交互作用對NR的影響不明顯。

圖5 Alcalase 2.4L酶解過程中影響菜籽蛋白水解度DH的響應(yīng)面圖

2.3.4 模型的優(yōu)化與驗證

利用 Design-Expert軟件，在試驗因素取值范圍內(nèi)，當(dāng)響應(yīng)值選取最大值時，通過求解Alcalase 2.4L酶解菜籽蛋白為菜籽肽的二次多項模型的逆矩陣，可得到酶解菜籽蛋白的最佳工藝參數(shù)為，酶的使用量0.053 Au/g，pH 9.03，酶解溫度54.31 ℃；在此條件下，DH的預(yù)測值為34.89%，NR為52.52%。考慮到實際應(yīng)用，將數(shù)據(jù)修正為酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解溫度54 ℃；在此條件下，進(jìn)行模型驗證試驗，得到的實際DH和NR值分別為35.12%及52.96%，與回歸模型預(yù)測的理論值相差不顯著，僅為0.23%和0.44%，表明基于響應(yīng)面法得到的酶解制備菜籽肽的模型準(zhǔn)確可靠。

圖6 Alcalase 2.4L酶解過程中影響菜籽蛋白NR的響應(yīng)面圖

3 討論

油菜籽榨油后的餅粕中含35%～47%的蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)，為全價蛋白質(zhì)。但由于菜籽餅粕中含有硫甙、多酚和植酸等有毒物質(zhì)或抗?fàn)I養(yǎng)因子，這造成菜籽餅粕只能作為飼料或肥料使用，其價值遠(yuǎn)未被開發(fā)利用，造成植物性蛋白資源的極大浪費。本研究以脫脂“雙低”油菜籽為原料，芥酸和硫甙含量符合安全標(biāo)準(zhǔn)，菜籽分離蛋白等電點范圍分布在pH 4～7之間，植酸在pH 5左右時溶解性最大，多酚類物質(zhì)溶解于乙醇，可通過浸提和醇洗進(jìn)一步去除植酸及多酚類物質(zhì)，因此，本研究利用堿溶解結(jié)合酸沉淀的方法可制取得到優(yōu)質(zhì)的菜籽分離蛋白。

菜籽蛋白組分復(fù)雜，主要含有12S球蛋白和2S清蛋白。國內(nèi)外很少有文獻(xiàn)對堿溶酸沉法提取的混合菜籽蛋白的分子質(zhì)量分布進(jìn)行系統(tǒng)、深入研究的報道。本研究利用SDS-PAGE凝膠電泳法對菜籽分離蛋白的組分進(jìn)行了分析，表明我們所制取的菜籽分離蛋白的主要成分為2S清蛋白。而Chabanon等[4]利用堿溶酸沉法提取的菜籽分離蛋白主要組分為12S谷蛋白，這可能與菜籽蛋白的組成和油菜籽的品種有關(guān)。

僅以單一指標(biāo)(水解度或肽得率)為響應(yīng)值來優(yōu)化菜籽肽的制備條件，不能全面反映菜籽蛋白的酶解效果。本研究綜合考慮水解度和氮回收率2個指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化菜籽分離蛋白的酶解工藝條件，從而獲取了水解度和氮回收率均較高的菜籽蛋白水解物，為了后期菜籽肽生物活性和加工特性的研究做了鋪墊，利用酶法從菜籽蛋白中釋放生物活性肽對于深度開發(fā)利用菜籽蛋白產(chǎn)品具有重要意義。生物活性肽由于具有特殊的生理功能，利用食源性蛋白質(zhì)來制備活性肽是當(dāng)前國際研究熱點。菜籽分離蛋白經(jīng)酶水解后表現(xiàn)出的多種生物活性，相關(guān)研究結(jié)果我們將繼續(xù)進(jìn)行報道。

4 結(jié)論

SDS-PAGE凝膠電泳分析表明利用堿溶解酸沉淀提取所得的的菜籽分離蛋白的主要成分為2S清蛋白，2S清蛋白的含量大于12S菜籽谷蛋白。

通過Design Expert軟件采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法擬合了Alcalase 2.4L酶解菜籽分離蛋白的DH和NR的二次多項模型方程，該模型顯著；模型系數(shù)的顯著性檢驗表明，酶的使用量、pH、酶解溫度、酶的使用量與pH的交互作用對Alcalase 2.4L酶解過程中菜籽蛋白DH和NR的影響均極顯著。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化了Alcalase 2.4L酶解菜籽分離蛋白的工藝參數(shù)，最佳條件為酶的使用量0.05 Au/g，pH 9.0，酶解溫度54 ℃，在菜籽蛋白濃度為5%的條件下水解5 h，得到DH和NR的值分別為35.12%及52.96%，與回歸模型預(yù)測的理論值相差0.23%和0.44%，說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化Alcalase 2.4L酶解菜籽分離蛋白工藝條件具有實際應(yīng)用價值。

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Molecular Weight Distribution of Rapeseed Protein Isolate and Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process

Gao Yulong Zheng Rui Wang Yumei Wang Lifeng Ju Xingrong Yuan Jian
(Key Laboratory of Grain & Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023)

Defatted meal of double-zero rapeseed has been adopted as material in the paper. The methods of alkaline extraction and acid precipitation were employed to extract rapeseed protein isolate; SDS-PAGE gel electrophoresis has been adopted to explore the molecular weight distribution. On the basis of single-factor experiments, response surface methodology (RSM) was utilized to built second-order polynomial equations and to optimize conditions of enzymatic hydrolysis process with Alcalase 2.4L; the selected response values were degree of hydrolysis (DH) and nitrogen recovery (NR). Analyses by electrophoresis showed that this protein isolate was mainly composed of more 2S albumins than 12S globulins. The experimental results showed that adding enzyme amount, pH, temperature and the interaction of enzyme amount and pH would have a significant effect onDHandNR(P<0.05). Maximum yield was obtained according to the inverse matrix equation of the second-order polynomial model when enzyme amount added; pH and temperature were 0.05 Au/g, pH 9.0, 54 ℃, respectively. The conditions resulted in 35.12% ofDH, 52.96% ofNRafter 5 h hydrolysis with a rapeseed protein isolate substrate of 5%.

rapeseed protein isolates, SDS-PAGE gel electrophoresis, enzymatic hydrolysis, degree of hydrolysis, nitrogen recovery, response surface methodology

TS253.1

A

1003-0174(2014)06-0038-08

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金(2011GB2C100012，2012GB24490611)，國家科技支撐計劃(2012 BAD37 B08)，南京財經(jīng)大學(xué)預(yù)研究項目(Y2012014)

2013-06-17

高瑀瓏，男，1974年出生，博士，副教授，食品生物技術(shù)