肖志紅，吳 紅 ，李昌珠 ，張愛華，劉汝寬 ，吳曉芙

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙410004；2. 湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙410004）

固定化假絲酵母脂肪酶對光皮樹油的吸附性能

肖志紅1,2，吳 紅2，李昌珠2，張愛華2，劉汝寬2，吳曉芙1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙410004；2. 湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙410004）

通過TEM、比表面孔分布測定儀等對含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物載體(GHD)性能進(jìn)行了表征。以GHD為載體，制備了固定化假絲酵母脂肪酶。研究了光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪酶（I-CRL）上的吸附行為，從吸附平衡和吸附動力學(xué)角度探討了吸附機(jī)理。結(jié)果表明，光皮樹油在I-CRL上的等溫吸附過程符合Langmiur方程，為單分子層吸附。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能很好的擬合二級動力學(xué)吸附方程，當(dāng)采用聚合物GHD(40)為載體，初始光皮樹油濃度（Ce）為210 mg/g，在溫度為325 K，330 K，335 K時，由Arrhenius公式求得的表觀活化能Ea為30.44 kJ/mol，吸附過程為吸熱反應(yīng)。

光皮樹油；固定化假絲酵母脂肪酶；多孔高分子微球；吸附平衡；吸附動力學(xué)

脂肪酶在動、植物和微生物體內(nèi)普遍存在，是一種特殊的?；饷竅1]，可催化脂水解、縮合、酯交換、脂合成、氨解等[2-4]反應(yīng)，但游離脂肪酶的缺點(diǎn)也是顯而易見的，如穩(wěn)定性差，使用效率低，適應(yīng)反應(yīng)介質(zhì)能力弱等。酶的固定化方法有多種，其中共價鍵結(jié)合法具有酶與載體結(jié)合較為牢固，酶不易脫落及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。含有環(huán)氧基團(tuán)的高分子聚合物，表面的環(huán)氧基團(tuán)可以在溫和的條件下與酶分子的氨基共價結(jié)合[5-6]，使酶分子被固定于聚合物載體表面。借助環(huán)氧基團(tuán)實(shí)現(xiàn)酶的固定化，不僅條件溫和，酶分子不易脫落，載體不必預(yù)活化，同時，還可降低固定化過程對酶活力的損失，因而十分適合于工業(yè)固定化酶的生產(chǎn)。

在固定化脂肪酶制備生物柴油的過程中，在眾多酶活力發(fā)揮效用的因素中，固定化酶對底物的吸附能力是關(guān)鍵因素之一[7]。固定化酶與底物之間的作用力太大，不利于酯交換后底物的解吸附，作用力太小，又增加了底物與固定化酶接觸的傳質(zhì)阻力。目前對固定化酶與底物相互作用的研究較少。本文制備了一系列不同表面性能的載體，將制備的載體固定化假絲酵母脂肪酶。研究了光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪酶上的吸附行為，考察了載體和溫度等因素對光皮樹油吸附量的影響，并從吸附平衡和吸附動力學(xué)角度探討了光皮樹油在固定化脂肪酶上的吸附機(jī)理[8-10]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑

假絲酵母脂肪酶（sigma, L1754 - Type VII），光皮樹油（自制），甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA，≥95%）、甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，≥98%）、二乙烯基苯（DVB，≥98%），NaOH（分析純），甲醇（分析純），甲醇（色譜純，ACROS）。以上試劑除非特別特別說明，均購自上海國藥。

1.2 試驗(yàn)儀器

透射電鏡(日本日立，Hitachi-600)；全自動物理吸附微孔分析儀（Micromeritics, ASAP 2010）；紫外可見分光光度計(jì)（SPECRORD，210 plus）；索氏抽提器（上海本昂，SXT-06）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(瑞士Mettler Toledo)； GC-2014氣相色譜儀 (日本，島津儀器有限公司)。

1.3 多孔高分子微球載體的制備

多孔高分子微球載體的制備采用懸浮聚合法，在100 mL三角燒瓶中加入50 mL含2 %的可溶性淀粉的飽和氯化鈉溶液作為連續(xù)相，以甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、二乙烯基苯（DVB）和正庚烷為分散相。以物質(zhì)的量之比HEMA∶H∶（GMA + DVB）=3∶1∶6。將上述懸浮液倒入100 mL三口燒瓶中，三口燒瓶固定在恒溫水浴鍋中，分別接好機(jī)械攪拌器、冷凝管和氮?dú)鈱?dǎo)氣管，通入氮?dú)?，升溫，待溫度升高?0 ℃，加入引發(fā)劑過氧化二苯甲酰，氮?dú)夥障麻_啟攪拌至450 r/min，反應(yīng)3 h。離心分離。先用70 ℃蒸餾水沖洗幾次，之后用丙酮抽提12 h，抽提物用NaOH/甲醇溶液醇解12 h，最后用去離子水洗至中性，真空下50 ℃干燥，得到多孔微球GHD。共聚物用GHD(w)表示，其中w為交聯(lián)劑DVB所占的比例。除非特別標(biāo)明，上述所有藥品都是分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 聚合物的性能測試

多孔高分子微球環(huán)氧值測定采用GB 1677-8，共聚載體吸水率的測定采用常規(guī)水浸泡溶脹法，吸水率α=[(w-wo)/wo]×100%，式中wo, w分別代表共聚載體溶脹前后的質(zhì)量。全自動物理吸附微孔分析儀（Micromeritics, ASAP 2010）測定比表面積及孔徑分布儀，比表面積采用BET法。透射電鏡(日本日立，Hitachi-600)測聚合物的微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 固定化酶的制備

將1.0 g載體加入到20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %的pH值為7.2的假絲酵母脂肪酶（sigma, L1754-Type VII）溶液中，在震蕩箱中37 ℃反應(yīng)7 h，離心分離。固定化酶用磷酸緩沖溶液洗3次后水洗3次，常溫下真空干燥，制得固定化脂肪酶。酶活力測定參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，用紫外-可見分光光度計(jì)（SPECRORD，210 PLUS）測定未固定化的蛋白質(zhì)的吸光度，從而確定固定到載體上的脂肪酶的量。

1.6 吸附平衡實(shí)驗(yàn)

取一定量的光皮樹油溶解于200 mL叔丁醇中，加入5 g固定化酶聚合物，置于恒溫振蕩器中150 r/min吸附24 h后，測定光皮樹油的吸附量，采用光皮樹油甲酯化后氣相色譜FID檢測器未被吸附的光皮樹油的含量。由吸附前后的光皮樹油的濃度差計(jì)算吸附量。

1.7 吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取不同量的光皮樹油溶解于200 ml叔丁醇中，加入5 g固定化酶聚合物，將裝有混合體系的具塞錐形瓶置于震蕩箱中反應(yīng)24 h，震蕩速度150 r/min，溫度設(shè)定為（25, 30, 35或40℃）。反應(yīng)中每隔2 h移取1 mL反應(yīng)液用0.22 μm濾膜過濾，測定光皮樹油的吸附量，采用光皮樹油甲酯化后氣相色譜FID檢測器未被吸附的光皮樹油的含量。通過計(jì)算可得出光皮樹油在GHD表面的吸附量隨時間的變化。

式（1）中：qt為時間t時光皮樹油的吸附量；C0為初始光皮樹油濃度；Ct為光皮樹油未被吸附量；V為溶液的體積；m為固定化酶的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM分析

圖1中是GHD(40)高分子微球載體通過餓酸染色，干透后常溫切片的透射電鏡照片，粒子的直徑為4 μm左右，粒子直徑分布較為均一。制備的高分子微球載體適合通過離心的方法進(jìn)行固液分離，足夠大的比表面積也有利于脂肪酶的分散，從而增加脂肪酶與光皮樹油的接觸面積。照片顯示高分子多孔微球載體的表面具有多孔結(jié)構(gòu)。

圖1 多孔高分子微球的透射電鏡照片F(xiàn)ig. 1 TEM micrograph of porous polymer micro-sphere

2.2 聚合物載體性能分析

固定HEMA和致孔劑正庚烷的比例，通過改變GMA和作為交聯(lián)劑的DVB的比例，得到了不同表面結(jié)構(gòu)和孔結(jié)構(gòu)的高分子微球載體，表1中可以看出，交聯(lián)劑含量增加，在叔丁醇中的溶脹性能、環(huán)氧值和孔徑都減小，比表面積增大，在給酶量為200 mg·g-1的條件下，吸附量依次減小，對應(yīng)的酶活也相應(yīng)減小。

表1 聚合物載體的性能Table 1 Characters of polymer carriers

2.3 光皮樹油濃度的影響

圖2是不同濃度光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪酶上的吸附量，在溫度42 ℃，初始光皮樹油濃度為 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 mg·g-1的叔丁醇溶液中吸附24 h的平衡吸附線。從圖2中可以看出，在相同的光皮樹油濃度下，達(dá)到吸附平衡時，以GHD(40)為載體的固定化酶吸附的光皮樹油最多，以GHD(20)為載體的固定化酶吸附的光皮樹油最少，這要?dú)w結(jié)于載體的比表面積的影響，也可能是載體上酶量不同引起的。

圖2 不同濃度光皮樹油在固定化CRL上的吸附平衡Fig.2 Equilibrium adsorption of S. wilsoniana oil onto immoblized CRL

將吸附等溫線用Langmuir 方程擬合，Langmuir 方程式能很好的描述單分子層吸附，擬合結(jié)果見表2和表3。

表2 載體對光皮樹油的Langmuir吸附平衡常數(shù)Table 2 Langmuir isotherm constants of carriers

Langmuir 方程式為

式（2）中：Ce為吸附平衡時光皮樹油的濃度；qe為吸附平衡時光皮樹油的吸附量；Q為飽和吸附量；b為吸附系數(shù)，其大小與吸附劑、吸附質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，b越大，表明吸附能力越強(qiáng)以Ce/qe對Ce作圖，得到圖3所示的直線，通過直線的斜率和截距可以求得Q和b。

由表2和圖3可以看出，擬合的Langmuir方程具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明光皮樹油在固定化CRL上的吸附是單分子層吸附。GHD(40)為載體的固定化假絲酵母脂肪酶達(dá)到吸附平衡時吸附的光皮樹油最多，而GHD(20)的速度最快，但是最終達(dá)到吸附平衡時吸附的光皮樹油最少。因而通過調(diào)節(jié)不同的載體組成，可以實(shí)現(xiàn)固定化假絲酵母脂肪酶吸附光皮樹油的最佳的吸附條件，使光皮樹油轉(zhuǎn)化生物柴油的速度最快。

圖3 固定化酶載體對光皮樹油的Langmuir吸附平衡線Fig.3 Langmuir isotherms for different GHD to S. wilsoniana oil

2.4 溫度對脂肪酶吸附量的影響

圖4 是以GHD(40)為載體的固定化假絲酵母脂肪酶，在初始光皮樹油濃度為210 mg·g-1時，325 K，330 K，335 K時固定化CRL吸附光皮樹油的量與時間的關(guān)系曲線。從圖4中可以看出，吸附7 h后，不同溫度下光皮樹油在固定化酶上均達(dá)到吸附平衡，且隨著溫度升高，光皮樹油的平衡吸附量增加。這說明溫度升高有利于光皮樹油在固定化CRL上的吸附，光皮樹油的吸附過程是吸熱反應(yīng)。

圖4 溫度對光皮樹油吸附量的影響Fig.4 Effects of temperature on adsorption capacity for S. wilsoniana oil

2.5 動力學(xué)二級吸附方程為

式(3)中：qe和q分別為吸附平衡時和t時的脂肪酶的吸附量，k為二級吸附速率常數(shù)。用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合準(zhǔn)二級吸附速率方程得到qe和動力學(xué)常數(shù)k的值見表3，系數(shù)達(dá)到0.999以上，表明光皮樹油在固定化CRL上的吸附能夠很好的擬合動力學(xué)二級吸附方程。光皮樹油初始濃度為210 mg·g-1時，溫度為325K，330K，335K時（t/q）-t的關(guān)系曲線，由直線的截距和斜率可以得到k和qe。

表3 光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪酶上吸附的準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)參數(shù)Table 3 Pseudo-second-order adsorption kinetic parameters for S. wilsoniana oil on immobilized CRL

圖5 光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪上吸附的準(zhǔn)二級動力學(xué)曲線Fig.5 Pseudo-second-order kinetic plots of S. wilsoniana oil on immobilized CRL

2.6 表觀活化能

表觀活化能可由Arrhenius公式求得：

式（4）中A為指前因子，Ea為活化能，k2為動力學(xué)常數(shù)。R是氣體常數(shù)，T是溶液的溫度。lnk2對T作圖得一直線，如圖6所示，由直線的斜率可以得到固定化CRL吸附光皮樹油的表觀活化能Ea為 30.44 kJ·mol-1。為吸熱反應(yīng)。

3 結(jié) 論

圖6 固定化假絲酵母脂肪酶吸附光皮樹油的Arrhenius曲線Fig.6 Arrhenius curve for adsorption of S. wilsoniana oil on immobilized CRL

通過懸浮聚合法制備了多孔高分子微球載體GHD，并用制備的三種不同的聚合物載體對假絲酵母脂肪酶進(jìn)行了固定化。在叔丁醇中，以GHD(40)為載體的固定化假絲酵母脂肪酶對光皮樹油的吸附量越多，以GHD(20)為載體的固定化假絲酵母脂肪酶對光皮樹油的吸附速度最快，而GHD(30)吸附量和吸附速度居中，表明可以調(diào)節(jié)載體的性質(zhì)來控制吸附速度和吸附量。固定化假絲酵母脂肪酶吸附光皮樹油的吸附等溫線能夠很好的擬合Langmiur方程，相關(guān)系數(shù)大于0.99，表明該吸附過程可以用 Langmuir 方程很好的描述,表明光皮樹油在GHD載體上的吸附主要是單分子層吸附?？疾炝斯潭ɑ篙d體和溫度對光皮樹油吸附量的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠很好的擬合動力學(xué)二級吸附方程，相關(guān)系數(shù)大于0.999。通過準(zhǔn)二級動力學(xué)吸附速率常數(shù)k關(guān)聯(lián)Arrhenius方程，得到吸附活化能為30.44 kJ·mol-1，光皮樹油在固定化假絲酵母脂肪酶上的的吸附過程為吸熱反應(yīng)。

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Adsorption kinetics of immoblized candida lipase to Swida wilsoniana oil

XIAO Zhi-hong1,2, WU Hong2, LI Chang-zhu2, ZHANG Ai-hua2, LIU Ru-kuan2, WU Xiao-fu1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

A polymeric carrier (GHD) supported with epoxy groups was characterized by TEM and Micromeritics ASAP 2010(a kind of specif i c surface pore distribution analyzer). The immobilized candida lipase (I-CRL) was prepared with GHD as the carrier, further the adsorption performance of Swida wilsoniana oil on I-CRL was studied, and the adsorption mechanisms were investigated from the angles of adsorption equilibrium and kinetic. The results show that the isothermal adsorption of S. wilsoniana oil on I-CRL well agreed with that of Langmiur isothermal model, indicating that the adsorption of S. wilsoniana oil oil on I-CRL was a monolayer adsorption.The experimental data fi tted well to the second-order kinetic model in the case that GHD (40) as carrier and the initial Cewas 210 mg/g.At the meantime, the apparent activation energy (Ea= 30.44 kJ/mol) can be calculated based on Arrhenius equation by the data obtained at 325 K, 330 K and 335 K. The adsorption of Swida wilsoniana oil on I-CRL was proved to be an endothermic reaction.

Swida wilsoniana oil; immobilized candida lipase; porous polymer micro-sphere; adsorption equilibrium; adsorption kinetics

S727.32

A

1673-923X(2014)02-0117-05

2013-05-16

國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004071）；國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD22B04）；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ2141）

肖志紅（1974-），男，副研究員，主要從事生物質(zhì)能研究；E-mail：xzhh1015@163.com

[本文編校：吳 彬]