肖志娟，翟梅枝，王振元，許 靜，李 麗，楊 惠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

微衛(wèi)星DNA在分析核桃遺傳多樣性上的應(yīng)用

肖志娟，翟梅枝，王振元，許 靜，李 麗，楊 惠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

研究不同核桃品種的遺傳多樣性，為今后新品種的培育和種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)，以西北農(nóng)林科技大學(xué)資源苗圃的18個(gè)核桃品種（包括3個(gè)實(shí)生優(yōu)系）嫩葉做材料，選用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了遺傳多樣性研究。建立了最適PCR反應(yīng)體系，從27對(duì)引物中篩選出多態(tài)性強(qiáng)重復(fù)性好的12對(duì)引物，共檢測(cè)出174條條帶，其中91條呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性條帶的比例平均為67.82%，平均每條引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)9.8個(gè)。新疆2號(hào)與遼寧4號(hào)的相似系數(shù)最大（0.803 6），青林和西林2號(hào)最小（0.159 4）。多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍在0.742 2～0.896 2，平均值為0.815 0，其值均大于0.500 0。基于遺傳相似性系數(shù)的UPGMA聚類結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)閾值為0.39左右可將供試品種分成4大類。以上說明12條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)，同時(shí)表明供試樣品遺傳資源非常豐富，可作為育種來源。

核桃；SSR分子標(biāo)記技術(shù)；體系優(yōu)化；遺傳多樣性

核桃屬Juglans植物約有20多種,而核桃是中國(guó)栽培范圍最廣的種，也是我國(guó)分布廣泛，栽培歷史悠久的重要經(jīng)濟(jì)樹種, 在國(guó)際市場(chǎng)上與扁桃、腰果、榛子一起并列為世界四大干果[1]，其種仁除含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪外，還含胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、鈣、磷、鐵和尼克酸等多種成分[2]，具有很高的藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

核桃種質(zhì)資源極為豐富,在抗性、豐產(chǎn)性及果實(shí)品質(zhì)和形態(tài)特征等方面都存在顯著差異，具有豐富的遺傳多樣性[3]。由于核桃品種眾多，在地形、氣候條件等不同生態(tài)環(huán)境條件下, 經(jīng)長(zhǎng)期的異花授粉、自然選擇和人工雜交，導(dǎo)致其遺傳背景非常復(fù)雜。核桃遺傳多樣性研究是核桃種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用的基礎(chǔ)，開展核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)對(duì)研究核桃的起源、演化具有重要意義。

準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)核桃種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及遺傳多樣性,對(duì)種質(zhì)資源的分類、親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見性的指導(dǎo)，這是關(guān)系到育種目標(biāo)能否成功實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵[4]。以往對(duì)核桃種質(zhì)資源的研究多依靠形態(tài)學(xué)[5]、細(xì)胞學(xué)[6]、酶學(xué)[7]等手段。近年來，DNA 分子標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、不受組織類別、發(fā)育時(shí)期和環(huán)境條件影響的優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于核桃種質(zhì)資源的研究[8]。分子標(biāo)記技術(shù)具有快速、方便、直觀、成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)越來越普遍地應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的系統(tǒng)演化、遺傳多樣性、分子輔助育種等方面的研究，成為植物種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)研究的重要技術(shù)[9-10]，在核桃種質(zhì)資源研究方面的應(yīng)用有不少報(bào)道[11-14]。吳燕民等[15]用RAPD標(biāo)記研究了核桃屬各個(gè)種之間的親緣關(guān)系。王滑等[16]利用SSR標(biāo)記揭示我國(guó)核桃和鐵核桃天然居群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu),為其遺傳資源的保護(hù)、可持續(xù)利用和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。國(guó)外學(xué)者利用形態(tài)學(xué)、等位酶及RFLP標(biāo)記對(duì)歐洲及亞洲的核桃居群作了分析比較，SSR分子標(biāo)記技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的、以PCR為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)，具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和遺傳信息量大的特點(diǎn)，是較為理想的分子標(biāo)記[17]。黑核桃SSR的成功提取及對(duì)核桃栽培品種的研究顯示SSR標(biāo)記技術(shù)可能成為核桃屬植物多樣性研究的有效工具[18]。筆者運(yùn)用SSR分子標(biāo)記對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)資源苗圃的18份核桃材料進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，為今后選擇親本雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料的采集和處理

試驗(yàn)材料包括15個(gè)核桃品種和3個(gè)實(shí)生樣品。于四月上旬，采集其新鮮嫩葉，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80°冰箱中保存待用，所有材料均采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃實(shí)驗(yàn)基地。（詳見表1）

表1 供試核桃品種名稱及來源Table 1 Walnuts cultivars collected in the course of this study

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法[19]提取DNA，用分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的濃度與質(zhì)量（見圖1）。獲得濃度和純度符合要求的DNA，將其稀釋至100 ng·μL-1，存于-20 ℃?zhèn)溆?。DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）=A260×50×稀釋倍數(shù)

1.2.2 引物

1.2.2.1 引物的合成及來源

SSR 引物來自于黑核桃（J. nigra）和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)開發(fā)的引物[20]共27對(duì)，由英濰捷基有限公司合成 。

圖1 核桃DNA提取物的電泳檢測(cè)Fig.1 Result of agarose electrophoresis of walnuts DNA

1.2.2.2 引物的篩選和退火溫度的確定

選用西洛3號(hào)、綠香和藝核1號(hào)3個(gè)品種對(duì)合成的27對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增條帶穩(wěn)定清晰且多態(tài)性好的多條引物進(jìn)行研究，并探索其退火溫度

1.2.2.3 PCR反應(yīng)程序和體系的優(yōu)化

SSR反應(yīng)程序采用：94 ℃變性3 min，94 ℃30 s，Tm 45 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min 延伸，最后 4 ℃保存。

由于PCR反應(yīng)體系中各個(gè)因素，如Mg2+，Taq酶，dNTP，模板，和引物濃度等的大小直接影響到擴(kuò)增效率，進(jìn)而影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此有必要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。體系的優(yōu)化采用采用五因素四水平L16(45)的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，用20 μL的反應(yīng)體系，Buffer均為2 μL，不足20 μL加水補(bǔ)足，三次重復(fù)，各因素水平優(yōu)化結(jié)果為：Taq酶0.5 U，Mg2+4 mmol·L-1，引物 0.8 pm·L-1，模板 120 ng，dNTP0.4 mmol·L-1，10×Buffer2 μL，水 11.9 μL。

1.2.3 電泳及凝膠成像

SSR引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，250 V欲電泳30 min后，5 μL樣與1 μL6×Loading buffer混勻后上樣，緩沖液用1×TBE，在250 V電壓下電泳3 T。電泳過后用1%的硝酸銀染色，再經(jīng)過15% NaOH顯色拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

以DM2000為標(biāo)準(zhǔn)，同一個(gè)引物擴(kuò)增后，經(jīng)過電泳，凝膠上同一位置上的條帶被認(rèn)為屬于同一位點(diǎn)且具有同源性，每個(gè)條帶視為一個(gè)標(biāo)記。故根據(jù)條帶的有無，記錄數(shù)據(jù)，有條帶的記錄1，無條帶的記錄0，計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），并經(jīng)過NT-SYSpc2.1[21]軟件分析得出遺傳相似系數(shù)（GS）和樹狀圖。

式（1）中：Pi、Pj分別為群體中第i、j個(gè)等位基因頻率，k為等位基因數(shù)。

式（2）中：Ni為供試樣品i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)，Nj為供試材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)，Nij為供試材料i和j共有的擴(kuò)增片段個(gè)數(shù)。用SAHN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記結(jié)果及其引物的退火溫度，PIC值分析

篩選出來的12對(duì)引物對(duì)供試樣品進(jìn)行擴(kuò)增之后，把在凝膠上有同一遷移率的條帶做為一個(gè)同源位點(diǎn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后從27對(duì)SSR引物中篩選出12對(duì)有穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段的大小大多在100～500 bp之間。12條引物的共擴(kuò)增出174條譜帶，其中多態(tài)性條帶118條，占總條帶數(shù)的67.82%。引物WGA33 擴(kuò)增的條帶數(shù)最多為17條，引物ZMZ44次之為15條。引物WGA82，ZMZ31，ZMZ45 擴(kuò)增的譜帶數(shù)最少，均為6條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為9.83條。圖1為引物ZMZ31擴(kuò)增后的電泳圖譜，圖中以50 bp Ladder作為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。最右側(cè)的 泳道M為來自康為世紀(jì)的50 bp Ladder 擴(kuò)增的結(jié)果，其作為分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)，中間的從左到右編號(hào)為1，2，3，……，17，18等十八個(gè)泳道依次為十八個(gè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2 引物ZMZ31對(duì)18份供試材料的ISSR擴(kuò)增電泳Fig.2 Electrophoresis pattern amplif i ed from 18 tested materials with primer ZMZ31?

對(duì)SSR的27對(duì)引物進(jìn)行退火溫度的探索，運(yùn)用梯度PCR進(jìn)行擴(kuò)增，溫度梯度設(shè)為40～56八個(gè)濃度梯度，各個(gè)引物的Tm均包含在其中。選用形態(tài)差異大的3個(gè)核桃品種西洛3號(hào)，藝核1號(hào)，綠香進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于SSR的引物采用不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增后，結(jié)果表明差異不明顯，因此均采用45°進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。引物特征見表4。

多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）是表示DNA變異程度的一個(gè)指標(biāo)，反應(yīng) DNA多態(tài)高低，位點(diǎn)的PIC值均大于0.50,表明具有較高的多態(tài)信息量,在核桃組內(nèi)遺傳分析中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)PIC值＞0.5 時(shí), 標(biāo)記具有高度可供信息性；0.50＞PIC＞0.25 時(shí),標(biāo)記能夠較合理的提供信息；PIC值＜0.25 時(shí)，標(biāo)記可供信息性差[22]。12對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果的PIC值，最大值為0.896 2，最小值為0.742 2，其平均值為0.815 0，其值均大于0.5，說明本研究中的12對(duì)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)均表現(xiàn)出高度多態(tài)，表明供試樣品遺傳資源非常豐富，見表2。

表2 參試8對(duì)SSR引物的特征及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Characteristics of eight pairs of SSR primers and PCR results

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

根據(jù)Nei等[23]的方法，18個(gè)供試樣品間的遺傳相似系數(shù)見表3，其平均遺傳相似系數(shù)為0.406 9。由表可看出，18個(gè)供試品種（優(yōu)系）中，實(shí)生類型的優(yōu)良株系間相似系數(shù)最大。實(shí)生優(yōu)系2和3的相似系數(shù)達(dá)到了1.000，實(shí)生優(yōu)系1和2，3的相似系數(shù)達(dá)到了0.888 9，0.888 9。在供試的15個(gè)優(yōu)良品種中，吐萊爾與實(shí)生優(yōu)系的相似程度最大。吐萊爾與實(shí)生優(yōu)系1，2，3的相似系數(shù)分別為0.769 2，0.805 6，0.805 6，故推斷吐萊爾與3個(gè)實(shí)生優(yōu)系親緣關(guān)系較近。品種間新疆2號(hào)和遼寧4號(hào)遺傳相似系數(shù)最大，為0.803 6，青林和西林2號(hào)之間遺傳相似系數(shù)最小，為0.159 4。綜上可知18個(gè)核桃品種豐富，可作為育種來源。

2.3 聚類分析

用軟件NSTYS-PC進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出18個(gè)樣品的遺傳相似系數(shù)后，并利用不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析得到樹狀圖見圖2所示，NSTYS-PC數(shù)據(jù)分析顯示，樹狀圖的r值為0.833 2，在0.8和0.9之間，說明此進(jìn)化樹符合較好。在遺傳相似系數(shù)閾值為0.39左右可將供試品種分成四大類：第一類1西洛3號(hào) 2.S1 3.S2 4.S3 5.清香6.西林3號(hào) 10.香玲11.吐萊爾12.溫185 13.遼寧4號(hào) 15.新疆2號(hào)；第二類7.西林2號(hào)；第三類8.維納9.契可14.藝核1號(hào)；第四類，16.青林 17.W06-1 18.綠香。

表3 供試樣品的相似系數(shù)Table 3 Similarity coefficients of tested samples

圖3 18個(gè)核桃品種的遺傳多樣性聚類?Fig.3 Dendrogram of 18 walnut varieties based on genetic similarity

3 討 論

簡(jiǎn)單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，在真核生物中，存在許多2～5 bp簡(jiǎn)單重復(fù)序列，稱為“微衛(wèi)星DNA”其兩端的序列高度保守，可設(shè)計(jì)雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，揭示其多態(tài)性。 SSR長(zhǎng)度變異極大，標(biāo)記的多態(tài)性非常高，信息量也很豐富；而且一旦開發(fā)出合適的特異引物，檢測(cè)分析就變得簡(jiǎn)單易行，因而在品種鑒定和多樣性分析中有很高的應(yīng)用價(jià)值。但SSR標(biāo)記兩端序列保守，所以設(shè)計(jì)的引物必須與兩端保守序列互補(bǔ)，這給微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用帶來一定的困難。因此要想開發(fā)一套某種生物的微衛(wèi)星標(biāo)記，是一個(gè)過程繁瑣、工作量大、效率低、花費(fèi)大的工作，從而使得SSR的應(yīng)用受到一定限制。目前，核桃上SSR引物的來源有兩種，一種是已經(jīng)開發(fā)得來的近緣種黑核桃的SSR引物，研究顯示黑核桃微衛(wèi)星可用于核桃屬植物進(jìn)化和分類學(xué)方面的研究[24]，在本實(shí)驗(yàn)中引物名稱前代號(hào)為WGA的都是來自黑核桃的引物；一種是利用生物信息學(xué)方法對(duì)NCBI網(wǎng)上公開的5 213條胡桃ESTs序列進(jìn)行EST-SSR特征分析，利用利用Primer3.0軟件對(duì)篩選出的EST序列設(shè)計(jì)引物[25]。

傳統(tǒng)分類是以主要形態(tài)特征為依據(jù)，采用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定植物品種具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)植物品種的分類常常與傳統(tǒng)的分類方法不一致。作為傳統(tǒng)分類的補(bǔ)充，SSR 標(biāo)記可減少由形態(tài)描述和環(huán)境條件產(chǎn)生的誤差，從分子水平鑒定個(gè)體和群體間的差異，分子標(biāo)記方法是通過多個(gè)不同引物給出覆蓋整個(gè)基因組的多態(tài)性信息，由于目前常用的分子標(biāo)記方法如RAPD、ISSR、SSR等，標(biāo)記的數(shù)量有限，不能構(gòu)建飽和的SSR指紋圖譜，不能標(biāo)記所有的功能基因，因此兩種分類系統(tǒng)在某些情況下不可能完全吻合。本試驗(yàn)中西洛3號(hào)晚實(shí)品種與早實(shí)品種香玲、吐萊爾等早實(shí)品種列為一類，這與王紅霞等[26]在種群聚類中，把早實(shí)與晚實(shí)品種聚在一起，說明通過聚類分析難以將早實(shí)核桃和晚實(shí)核桃截然分開相一致。龐曉明等[27]對(duì)枳屬種質(zhì)的 AFLP分子標(biāo)記分析也得出相似的結(jié)論，羅正榮等[28]對(duì)日本甜柿、中國(guó)原產(chǎn)澀柿和甜柿的 RAPD 分子標(biāo)記結(jié)果的聚類分析中，澀柿和甜柿同樣未被區(qū)分開。

基于分子標(biāo)記的遺傳分析（親緣關(guān)系分析）為核桃育種提供參考根據(jù)雜交理論，雜交親本的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，獲得雜種優(yōu)勢(shì)的可能性越大，但是遺傳距離越遠(yuǎn)雜交成功率就越低。對(duì)這些豐富的核桃種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)、研究，選擇親本進(jìn)行雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新時(shí)利用分子標(biāo)記輔助是當(dāng)前新品種培育的一個(gè)發(fā)展方向。

[1] 郗榮庭,張毅萍.中國(guó)果樹志·核桃卷[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社,1996.

[2] 高煥章,張 義,李秋杰,等.世界核桃產(chǎn)銷概況與湖北名優(yōu)產(chǎn)品開發(fā)對(duì)策[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,20(2):141-143.

[3] 郗榮庭, 張毅萍.中國(guó)核桃.北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1992.

[4] 高 翔,龐紅喜,裴阿衛(wèi).分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J] 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,36(4):356-359

[5] 奚聲珂.我國(guó)胡桃屬(Juglans L.)種質(zhì)資源與核桃(Juglans regia L.)育種[J].林業(yè)科學(xué),1987,23(3): 342-350.

[6] 穆英林,郗榮庭,呂增仁.核桃屬部分種的小孢子發(fā)生及核型研究[J].武漢植物學(xué)研究.1990,8(4):301-310.

[7] 楊自湘,奚聲珂.胡桃屬十種植物的過氧化物同工酶分析[J].植物分類學(xué)報(bào),1989,27(1):53-57.

[8] 陳 新,張士剛,魏海蓉,等.陜西核桃實(shí)生居群遺傳多樣性ISSR 分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,44(5):1-4.

[9] 湯正輝,祝亞軍,譚曉風(fēng),等. 河南連翹種群遺傳多樣性的ISSR 分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(8):32-37.

[10] 朱炳耀,楊志敏, 莊志鴻,等. 不同區(qū)域小油桐種質(zhì)差異與ISSR 分子標(biāo)記研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(4):13-16.

[11] 王 滑,郝俊民,王寶慶,等.中國(guó)核桃8個(gè)天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(7):121-126.

[12] 陳少瑜,楊 恩,張 雨,等.云南核桃品種遺傳多樣性的PAPD和ISSR標(biāo)記研究[J].河北林果研究,2007,22(1):56-58.

[13] DANIEL P, GAO F Y, GIOVANNAA. Inter-simple sequence repeat markers for fingerprinting and determining genetic relationships of walnut (Juglans regia) cultivars[J].Amer Soc Hort Sci, 2002,127(1):75-81.

[14] 陳少瑜,張 雨,陳 霞,等.27份核桃種質(zhì)資源親緣關(guān)系的ISSR分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2012,27(4):108-112

[15] 吳燕民,裴 東,奚聲珂.運(yùn)用RAPD對(duì)核桃屬種間親緣關(guān)系的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2000,27(1):17-22.

[16] 王 滑,郝俊民,王寶慶,等.中國(guó)核桃8個(gè)天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(7):120-124.

[17] 鄒喻萍,葛 頌,王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京:科學(xué)出版社,2001, 68-107.

[18] Dang G S, Woeste K,Aradhya M K, et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar –Identification of walnut[J]. AMER SOC HORT SCI, 2005,130(3): 348-354.

[19] 陳 靜, 王文江.適于 AFLP 分析的核桃幼葉 DNA 提取方法.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004, 27(6):44-47.

[20] 黃少勇,張智俊,羅淑萍,等.山核桃EST-SSR 引物的篩選及通用性分析,經(jīng)濟(jì)林研究[J],2013,31(3):10-15.

[21] RohlF FJ. NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system[M] .version 2.1.Exeter Pub New York ,2000.

[22] 況少青,張宇舟,陳 竺.基因組掃描-遺傳病相關(guān)基因定位的有力工具[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳雜志,1997,14(2):99-103.

[23] Nei M, LIW H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Natl A cad Sci, 1979, 76(10):5269-5273.

[24] 郝艷賓,肖永強(qiáng),齊建勛,等,微衛(wèi)星DNA在核桃屬近緣種同源性分析上的應(yīng)用[J],北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(3):1-4.

[25] 秦 玥,劉夢(mèng)培,傅大立,等 華仁杏SSR 標(biāo)記的篩選與評(píng)價(jià)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(3):72-76.

[26] 王紅霞,趙書崗,高 儀,等.普通核桃遺傳多樣性的 AFLP分析[J],中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,44(7):1434-1442.

[27] 龐曉明,鄧秀新,胡春根.枳屬 36 份特異種質(zhì)的 AFLP 指紋圖譜構(gòu)建與分析[J].園藝學(xué)報(bào),2003,30(4):394-398.

[28] 羅正榮,李發(fā)芳,蔡禮鴻.部分中國(guó)原產(chǎn)甜柿種質(zhì)的分子系統(tǒng)學(xué)研究[J].園藝學(xué)報(bào),1999, 26(5): 297-301.

Application of microsatellite DNA on analyzing genetic diversity of Juglans regia

XIAO Zhi-juan, ZHAI Mei-zhi, WANG Zhen-yuan, XU Jing, LI Li, YANG Hui
(College of Forestry, North West Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shanxi, China)

In order to study genetic diversity of different walnut varieties and to provide theoretical basis for breeding new varieties and obtaining new germplasm resources, the genetic diversities of the 18 Juglans regia species (including three strong and good seedling varieties) in nursery garden of North West Agriculture and Forestry University were studied by using SSR molecular marker technology.The PCR optimum system was set up; 12 primers with good repeatability and strong polymorphism were screened out from 27 primers;174 bands were amplif i ed out totally, in which 118 were pollymorphism bands, accounting for 67.82% of the total, the averaged number of the polymorphic loci of each primer was 9.8. The similarity coeff i cient between Xinjiang 2 and Liaoning 4 was the maximum (0.803 6), that between Qinglin and Xilin 2 was minimum (0.159 4)，the averaged value of the similarity coeff i cient was 0.815 0. Polymorphic information contents (PIC) ranged from 0.742 2 to 0.896 2, and all values were greater than 0.500 0. The cluster analyses with UPGMA method show that the 27 germplasm could be divided into 4 groups. It was indicated that 15 primers sites showed a high degree of polymorphism, also showed that the genetic resources of these samples were very rich.

Juglans regia; walnuts; SSR molecular markers; system optimization; genetic diversity

S722.3

A

1673-923X(2014)02-0055-07

2013-04-26

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004027）

肖志娟（1987-），女，河南澠池人，碩士研究生，主要從事林木遺傳改良方面的研究；E-mail：xzj525@126.com

翟梅枝（1963-），女，河南西平人，教授， 碩士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟(jì)林及資源利用的教學(xué)和科研工作；

E-mail：plum-zhai@163.com

[本文編校：文鳳鳴]