姚 軍，張麗芳，涂炳坤，丁昭全

（1.武漢市園林科學研究所，湖北 武漢 430081；2. 華中農(nóng)業(yè)大學 園藝林學學院，園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

基于ISSR標記的少果毛一球懸鈴木遺傳穩(wěn)定性分析

姚 軍1，張麗芳2，涂炳坤2，丁昭全1

（1.武漢市園林科學研究所，湖北 武漢 430081；2. 華中農(nóng)業(yè)大學 園藝林學學院，園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

本研究應用ISSR分子標記，對3個不同立地條件下的不同嫁接年限的少果毛一球懸鈴木優(yōu)良品種‘園科115’一球懸鈴木Platanus occidentalis‘Yuanke 115’的接穗(13 a、14 a與30 a)以及兩個相應的砧木（二球懸鈴木）進行遺傳穩(wěn)定性分析。16條引物在5個樣品中共擴增出75條譜帶，其中27條具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為36%。根據(jù)ISSR標記數(shù)據(jù)，基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析顯示：5個懸鈴木樣品間的遺傳相似系數(shù)在0.680 0～1.000之間，遺傳相似系數(shù)在0.77時，5個懸鈴木樣品歸為一類；遺傳相似系數(shù)在0.98時，3個不同嫁接年限的‘園科115’一球懸鈴木接穗歸為一類。其中，嫁接14 a與30 a的一球懸鈴木接穗的遺傳相似系數(shù)為1，它們與嫁接13 a的一球懸鈴木接穗的遺傳相似系數(shù)也高達0.986 7。以上結(jié)果說明：‘園科115’一球懸鈴木在不同的立地條件下，經(jīng)歷不同的嫁接時間（最長達30 a），依然具有高度的遺傳穩(wěn)定性。

‘園科115’一球懸鈴木；分子標記；遺傳穩(wěn)定性；ISSR分子標記

懸鈴木是全世界溫帶及亞熱帶廣為應用的園林綠化樹種，擁有無與倫比的優(yōu)良特性：生長迅速、冠大蔭濃、適應性強以及抗性優(yōu)良，被譽為“行道樹之王”。但是，懸鈴木果毛污染讓人深受其害。從自然界中選育遺傳穩(wěn)定的少果毛的突變品種，對現(xiàn)有的懸鈴木進行換冠嫁接，不啻為一種有效可行的解決手段。少果毛懸鈴木品種經(jīng)歷長時間的嫁接后，能否保持遺傳穩(wěn)定是非常關(guān)鍵而迫切需要回答的核心問題，關(guān)系到品種能否成功推廣。

‘園科115’一球懸鈴木Platanus occidentalis‘Yuanke 115’是武漢市園林科學研究所選育出的少果毛懸鈴木品種。該品種在武漢地區(qū)春季發(fā)芽較二球懸鈴木P. acerifolia晚7 d左右，秋季落葉較二球懸鈴木縮短2～4周，落葉時間短而集中，具有較強的頂端生長優(yōu)勢和明顯主枝。該品種在酸、堿性土壤和地下水位高的條件下都能正常生長發(fā)育，對高溫及輻射熱有較好的抗性，扦插與嫁接成活率較高，具有生長快、適應強、萌芽力強、耐修剪等特性，是一個優(yōu)良的少果毛品種[1]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記是1994年由Zietkiewicz等[2]創(chuàng)建的一種新型DNA分子標記技術(shù)，用于檢測簡單重復序列間DNA序列的多態(tài)性。它是基于SSR(simple sequence repeat)基礎上，在SSR一段序列的一端上加若干核苷酸堿基作為擴增引物，從而達到擴增SSR間隔序列的目的。與其它分子標記技術(shù)相比，ISSR特別適用于基因組信息知之不多的生物，具有引物設計簡單、穩(wěn)定性及重復性強、操作簡潔、譜帶多、成本低等特點。

ISSR技術(shù)在園林植物中也應用廣泛，主要應用于：品種親緣關(guān)系研究[3-7]、資源植物遺傳多樣性[8-11]、品種鑒定與分類[12-13]等。目前對于懸鈴木而言，主要采用AFLP、SSR分子標記等方法進行懸鈴木遺傳變異、遺傳多樣性及穩(wěn)定性的研究。其中黃文俊[14]、王艷梅[15]建立了ISSR分子標記方法，篩選出16條ISSR引物，可用于無果懸鈴木的遺傳分析。

本研究將對武漢市園林科學研究所提供的3個處于不同立地條件下的少果毛一球懸鈴木嫁接單株，即嫁接13 a、14 a以及30 a的單株，進行ISSR分子標記，以確定‘園科115’一球懸鈴木的遺傳穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

5個懸鈴木樣品：嫁接14 a的少果毛一球懸鈴木接穗（14優(yōu)，簡稱a）、嫁接14 a的二球懸鈴木砧木（14砧，簡稱b）、應用于單位綠地；嫁接30 a的少果毛一球懸鈴木接穗（30優(yōu)，簡稱c）、嫁接30 a的二球懸鈴木砧木（30砧，簡稱d）、作為庭蔭樹應用于居住區(qū)綠地；嫁接13 a的少果一球懸鈴木接穗（13優(yōu)，簡稱e）作為行道樹應用于道路綠地。

本試驗采取水培枝條萌發(fā)的新鮮葉片提取DNA，現(xiàn)采現(xiàn)提以保證DNA的質(zhì)量。

1.1.2 儀器與試劑

DNA提?。翰捎肂iomiga 公司植物DNA提取試劑盒、無水乙醇、β-巰基乙醇、無菌超純水。

ISSR引物（上海桑尼生物科技有限公司，見表1）、dNTPs（北京索萊寶）、10×Buffer（上海博彩）、TaqDNA聚合酶（上海博彩）、D2000 DNA Ladder（TIANGEN， 后 簡 稱 DL2000）、瓊 脂 糖（ 西 班 牙 ）、2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN）等。

表1 ISSR引物的序號和序列Table 1 Lists of ISSR primers and their sequences in this study

儀器：冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、DYY-6C型電泳儀、DYCP-33A型電泳槽、PCR-100TM（BIO-RAD）儀、凝膠成像系統(tǒng)（Gel Logic200 Imaging System）等。

1.2 方法

1.2.1 懸鈴木DNA的提取

采用Biomiga 公司植物DNA提取試劑盒提取。

1.2.2 懸鈴木基因組DNA質(zhì)量的檢測

1.2.2.1 紫外分光光度計分析

以洗脫DNA的超純水為空白對照，從提取的DNA樣品中取出2 μL，在紫外分光光度計下測定DNA在260 nm和280 nm下的吸光值，計算檢測的DNA的純度和濃度。

1.2.2.2 電泳分析

取4 μLDNA溶液點樣于1%的瓊脂糖凝膠，在100 V恒壓條件下，電泳30 min，溴化乙錠染色10 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀測、拍照。

1.2.3 ISSR-PCR反應體系篩選

以b和c兩個懸鈴木樣本DNA為材料對3種ISSR-PCR反應體系進行篩選：

體 系 1： 20 μL 的 反 應 體 系， 包 括 5 μL GA TaqMix、0.5 μmol/L ISSR 引 物、10 ng模 板DNA。PCR擴增反應程序為：94℃預變性3 min，94 ℃變性 30 s，58 ℃復性 45 s，72 ℃延伸2 min，梯度降溫（1℃/cycle）進行復性，5個循環(huán)后穩(wěn)定在53 ℃復性，再進行36個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 8 min[14]。

體系2： 20 μL的反應體系，包括終濃度為1×Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、1 U Taq酶、0.5 μmol/L ISSR引 物、10 ng模 板DNA。PCR擴增反應程序同體系1。

體系3： 25 μL的反應體系，包括10 mM Tris-Hcl（pH 8.3）、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、1 U Taq酶、0.2 μmol/L ISSR引 物、50～100 ng模板DNA。PCR擴增反應程序為：94℃預變性30 s，然后進行44個循環(huán)為94℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 45 s，最后 72℃延伸 8 min[15]。

1.2.4 ISSR擴增產(chǎn)物檢測

取 5 μLPCR 擴增產(chǎn)物與 1 μL Lording buffer混合，于1%的瓊脂糖凝膠上，在100 V電壓下，電泳150 min左右，溴化乙錠染色后檢測。

1.2.5 統(tǒng)計分析

將5個樣品重復試驗中擴增清晰、重復性好、分辨度高的條帶用于數(shù)據(jù)分析。以Marker為對比，按凝膠同一位置上的DNA條帶有無統(tǒng)計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，得到原始的“0”、“1”數(shù)據(jù)，構(gòu)成ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣。采用Nei等[16]的方法計算相似系數(shù)(GS) ：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中Ni和Nj分別為i和j兩材料的總等位基因數(shù)，Nij為i和j兩材料的共有等位基因數(shù)。遺傳差異(GD)=1-GS。應用NTSYS-PC（version2.10）軟件進行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸鈴木基因組DNA質(zhì)量的檢測

2.1.1 紫外分光光度計分析

通過紫外分光光度計檢測懸鈴木DNA的質(zhì)量，從表2中看出，5個懸鈴木樣品DNA的OD260/OD280值都在 1.8～2.0 之間，純度及質(zhì)量均能滿足 ISSR 反應。

2.1.2 電泳分析

從圖1可以看出，5個懸鈴木樣品的DNA質(zhì)量較好，膠孔干凈，無明顯拖尾，且?guī)土炼雀叨R，這說明DNA純度高，完整性好，適合下一步的ISSR擴增。

表2 懸鈴木DNA基因組紫外分析?Table 2 Ultraviolet analysis of genomic DNA of Platanus

圖1 懸鈴木DNA基因組電泳檢測Fig. 1 Electrophoresis detection of genomic DNA of Platanus

2.2 ISSR-PCR反應體系篩選

2.2.1 體系 1

以b（嫁接14 a的懸鈴木砧木）和c（嫁接30 a的少果懸鈴木接穗）為模板，對體系1進行篩選，凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2和圖3，結(jié)果表明：采用PCR MasterMix進行擴增，有12條引物可以擴出條帶，但清晰度差、多態(tài)帶少。

注：1-16表示引物編號，引物名稱見表1，M表示DL2000分子標記

圖3 14砧對反應體系1的篩選Fig.3 Screening of reaction system No.1 by rootstock grafted for 14 years

2.2.2 體系 2

以材料b和c為模板，對體系2進行篩選，凝膠電泳檢測如圖4和圖5，結(jié)果表明，大多數(shù)引物可以擴出清晰的多態(tài)條帶，因此擬用該體系進行下步PCR分析。

圖4 30優(yōu)對反應體系2的篩選Fig. 4 Screening of reaction system No. 2 by scion graftedfor 30 years

圖5 14砧對反應體系2的篩選Fig. 5 Screening of reaction system No.2 by rootstock grafted for 14 years

2.2.3 體系3

反應體系3無條帶擴出。

2.3 ‘園科115’一球懸鈴木接穗的遺傳穩(wěn)定性

以3個‘園科115’一球懸鈴木接穗（即a、c、e）為材料，用16條ISSR引物進行凝膠電泳分析，如圖6所示，16條引物將3個樣品一共擴增出63條清晰條帶。其中，有62條條帶在3個樣品中呈現(xiàn)一致性，只有第16條引物（ISSR44）在3個樣品中出現(xiàn)1條多態(tài)性條帶，材料e（嫁接13 a的接穗）出現(xiàn)一條特異的亮帶。由上可知，嫁接14 a與嫁接30 a的‘園科115’一球懸鈴木樣品對應的16條引物擴增的電泳條帶完全一致，擁有極高的遺傳穩(wěn)定性；而材料e在引物ISSR46電泳下，在750 bp片段大小處出現(xiàn)多態(tài)性條帶，說明嫁接13 a的‘園科115’一球懸鈴木較其它兩株嫁接14 a和嫁接30 a的接穗有差異，Nei's遺傳相似系數(shù)為99.47%；對于3個‘園科115’一球懸鈴木嫁接單株而言，群體遺傳差異為0.53%。根據(jù)對棗椰[13]遺傳變異的研究結(jié)果，遺傳差異低于2.6%被認為遺傳穩(wěn)定?！畧@科115’一球懸鈴木嫁接年限分別為13 a、14 a和30 a的3個接穗，雖然處于不同的立地環(huán)境條件，但是其遺傳差異僅僅為0.53%，遺傳非常穩(wěn)定，能保持親本的優(yōu)良遺傳性狀。

圖6 3個少果毛懸鈴木樣品凝膠電泳圖像（箭頭示多態(tài)性條態(tài)）Fig. 6 Gel electrophoresis image of three scion samples(arrows indicate polymorphic bands)

2.4 ‘園科115’一球懸鈴木接穗與對應的砧木間親緣關(guān)系

2.4.1 5個懸鈴木樣品ISSR遺傳多樣性分析

由圖7和8可知，以16條引物進行擴增，5個懸鈴木樣品之間存在多態(tài)性條帶。如表3，以16條引物共擴出75條條帶，平均每條引物擴出4.687 5條，其中多態(tài)性條帶27條，多態(tài)條帶百分率為36%。擴增條帶片斷大小在250～2 000 bp之間。由此可知，5個樣品間存在豐富的遺傳多樣性。其中12、13、16號引物多態(tài)性條帶比率較高，都在60%以上。

圖7 嫁接14 a‘園科115’一球懸鈴木與對應砧木凝膠圖像Fig. 7 Gel electrophoresis image of grafted 14 years plus tree and rootstock

圖8 嫁接30a‘園科115’一球懸鈴木與對應砧木凝膠圖像Fig.8 Gel electrophoresis image of grafted 30 years plus tree and root stock

表3 檢測5個懸鈴木樣品的遺傳相關(guān)性ISSR引物列表Table 3 ISSR primers list of 5 Platanu tested samples’Genetic eovariance

2.4.2 5個懸鈴木樣品遺傳相似度與聚類分析

從表4可以看出，5個懸鈴木樣品間的遺傳相似系數(shù)在0.680 0～1.00 0之間，其中14優(yōu)與30優(yōu)之間無差異，而這兩個懸鈴木樣品與13優(yōu)的遺傳相似系數(shù)均為0.986 7，相似度很高；14優(yōu)與14砧、30優(yōu)與30砧遺傳相似系數(shù)均為0.800 0。

表4 5個懸鈴木樣品種間相似系數(shù)?Table 4 Genetic similarity coefficients among 5 Platanus samples

基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析顯示（圖9），14優(yōu)與30優(yōu)間無差異；而遺傳相似系數(shù)在0.98～1.0以上可以把14優(yōu)、30優(yōu)與13優(yōu)3個單株歸為一類，說明3個‘園科115’一球懸鈴木嫁接單株遺傳相似度極高，結(jié)論與上述（2.3）相同。遺傳相似系數(shù)在0.80左右時，可以將3個‘園科115’一球懸鈴木接穗與14砧劃分為一大類；而在遺傳相似系數(shù)0.77左右將5個懸鈴木樣品劃分為一大類。

圖9 5個懸鈴木樣品的ISSR聚類分析樹Fig.9 Dendrogram for 5 Platanus by cluster analysis(UPGMA) based on ISSR marker

綜上所述，經(jīng)過長達14 a及30 a的嫁接時間，‘園科115’一球懸鈴木接穗與砧木之間遺傳差異顯著，而3個‘園科115’一球懸鈴木嫁接單株之間遺傳差異極小，由此可說明該少果毛品種——‘園科115’一球懸鈴木遺傳穩(wěn)定性高，多年嫁接后仍與母本性狀保持一致。3個‘園科115’一球懸鈴木材料分別嫁接于二球懸鈴木應用于單位綠地、居住區(qū)綠地和道路綠地，因此也可以說明不同的立地條件對該少果毛懸鈴木品種的遺傳特性影響較小。

3 討 論

本試驗通過對比3種PCR體系，確定了‘園科115’一球懸鈴木最佳ISSR反應體系，即：選用20 μL的反應體系，包括終濃度為1×Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、1 U Taq 酶、0.5 μmol/L ISSR引物、10 ng模板DNA。PCR擴增反應程序為：94℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃復性45 s，72 ℃延伸2 min，梯度降溫（1℃/cycle）進行復性，5個循環(huán)后穩(wěn)定在53 ℃復性，再進行36個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。

嫁接14 a及30 a后，2個‘園科115’一球懸鈴木接穗與對應砧木仍存在著較大的遺傳差異，其中嫁接14 a‘園科115’一球懸鈴木接穗與砧木、嫁接30 a‘園科115’一球懸鈴木接穗與砧木遺傳相似系數(shù)均為0.800 0，說明嫁接砧木與‘園科115’一球懸鈴木的間遺傳差異顯著。以嫁接13 a、14 a及30 a的3個‘園科115’一球懸鈴木為材料，通過16條ISSR引物凝膠電泳分析，認為3個嫁接單株遺傳相似度極高。以上結(jié)果說明嫁接多年后，該少果毛品種與母本仍保持一致，遺傳性狀穩(wěn)定，可以進行大面積推廣。

本研究采用可靠的ISSR分子標記，發(fā)現(xiàn)嫁接30 a與14 a的‘園科115’一球懸鈴木無任何遺傳變異。嫁接13 a的‘園科115’一球懸鈴木與嫁接14 a和30 a的單株也僅僅有1個位點的變異，還有待于進一步驗證?？梢哉f：各種立地環(huán)境條件和嫁接時間不改變‘園科115’一球懸鈴木的遺傳穩(wěn)定性。砧木也對接穗的遺傳組成無任何影響。

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Analysis on less fruit hair Platanus occidentalis genetic stability based on ISSR marker

YAO Jun1, ZHANG Li-fang2, TU Bing-kun2, DING Zhao-quan1
(1. Wuhan Institute of Landscape Gardening, Wuhan 430081, Hubei, China; 2. Key Lab. of Horticultural Plant Biology Supported by China Ministry of Education, College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China)

The analyses of genetic stability were performed on the 3 scions of Platanus occidentalis‘Yuanke 115’in different site conditions with different grafting time (13, 14 and 30 years respectively) and 2 corresponding rootstocks based on ISSR molecular marker. There were 75 bands in total amplified with 16 ISSR primers in 5 samples, of which 27 bands were polymorphic, and the polymorphic percentage was 36%. According to ISSR markers data, the cluster analysis based on genetic similarity coeff i cients was conducted. The results are as follows: The genetic similarity coeff i cients between 5 samples ranged from 0.6800 to 1.0000; 5 samples were grouped into one category with the genetic similarity coeff i cient of 0.77; The 3 scions were grouped into one category with the genetic similarity coeff i cient of 0.98; The genetic similarity coeff i cient between scions with 14 years and 30 years grafting time was 1.0000; Either of the scions with 14 years and 30 years grafting time had a genetic similarity coeff i cient of 0.9867 with the scion with 13 years grafting time. The results above show that P. occidentalis‘Yuanke 115’confers high level of genetic stability in different site conditions and through different period of grafting time (up to 30 years).

Platanus occidentalis‘Yuanke 115’; molecular makers; genetic stability; ISSR molecular marker

S722.3+1；S687.1

A

1673-923X(2014)02-0006-06

2013-05-15

武漢市園林局科研項目（武園[2009]55號）

姚 軍（1977-），男，湖北荊門人，高級工程師，主要從事園林植物繁育與應用研究；E-mail：yaojun77@gmail.com

涂炳坤（1952-），男，湖北羅田人，教授，博士生導師，主要從事林木良種選育、林木生理生態(tài)、工業(yè)原料林定向栽培、經(jīng)濟林栽培生理生化研究；E-mail：bktu@mail.hzau.edu.cn

[本文編校：文鳳鳴]