周 蕊

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng)712046)

0 概述

酵母多糖是從酵母細(xì)胞壁中提取的大分子碳水化合物的聚合物，主要成分是β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖包括（1,3）β-D-葡聚糖與少量的（1,6）連接葡萄糖和其他支鏈[1]。甘露聚糖通常以共價(jià)鍵和蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為甘露糖蛋白[2]。

β-D-葡聚糖通常稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRM）[3]。β-D-葡聚糖可以作為免疫應(yīng)答，抗癌，造血調(diào)控，保肝，降低膽固醇以及降血糖活性[4,5-8]。β-D-葡聚糖也有抗氧化的作用和能會(huì)加速傷口愈合的作用[9,10]。細(xì)胞壁甘露聚糖也有粘接性能[11]和抗原變異[12]。鑒于多糖以上所有的特性和用途，前人已有很多研究。但是大多數(shù)都是β-D-葡聚糖和甘露聚糖單獨(dú)提取。我們提出了一個(gè)同時(shí)生產(chǎn)兩種產(chǎn)品的新方法。這個(gè)方法過(guò)程簡(jiǎn)單，高效和易于轉(zhuǎn)換到大規(guī)模生產(chǎn)。

生產(chǎn)過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 廢酵母中β-D-葡聚糖和甘露聚糖的制備方法

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

固體含量為25%廢酵母泥：南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。酶:沈陽(yáng)諾維信生物技術(shù)有限公司。試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 多糖的含量測(cè)定采用苯酚硫酸法-與6%的苯酚濃度測(cè)定，于490nm紫外吸收處測(cè)定總糖，分別用葡萄糖和甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量[13]。

1.2.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定通過(guò)凱氏定氮分析儀測(cè)定總氮（福斯特卡托，公司，瑞典）根據(jù)AOAC正式方法。由總氮含量乘以6.25計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 灰分的測(cè)定

干燥后的樣品在600℃焚燒爐中測(cè)定灰分（林德伯格/藍(lán)色M，美國(guó)）[14]。

1.2.4 含鹽量的測(cè)定

用硝酸銀滴定法測(cè)定鹽，用作指示劑鉻酸鉀。

1.2.5 紅外光譜

β-D-葡聚糖和甘露聚糖紅外光譜分析在Nicolet 380光譜儀中進(jìn)行（熱電，美國(guó)）。樣品KBr壓片近似重量比為1:100[15]。

1.3 過(guò)程

1.3.1 預(yù)處理

由于廢啤酒酵母漿包含一些雜質(zhì)和無(wú)機(jī)離子。預(yù)處理是用蒸餾水洗滌混合物（300g）在室溫下以5000 rpm攪動(dòng)兩次，每次維持10分鐘。每次洗滌后放置在溫度4℃下冰箱中備用。

1.3.2 超聲處理

預(yù)處理后的酵母細(xì)胞壁是加入0.02M檸檬酸鹽緩沖液（添加堿調(diào)整到pH=7.2）得到的懸浮液中固體含量為15%。在室溫下在超聲波細(xì)胞破碎儀中（jy92-ⅡDN新芝生物科技有限公司，寧波）進(jìn)行超聲，程序設(shè)計(jì)為超聲2s停2s持續(xù)10分鐘。

1.3.3 高溫高壓提取

超聲后將懸浮液放入壓力為0.1MPa在高壓蒸汽滅菌器中高壓滅菌90min，溫度為121℃后冷卻到30℃。不溶性殘留物通過(guò)離心分離，并將檸檬酸鹽緩沖液與上清液（SUP）結(jié)合，存儲(chǔ)在4℃下。沉積物（SED）被用來(lái)提取β-D-葡聚糖。

1.3.4 β-D-葡聚糖的提取

（1）堿處理。

通過(guò)正交法L9（34）優(yōu)化提取條件。九種提取物分別在提取溫度為50℃,55℃和60℃，提取時(shí)間分別為2h、3h、4h，固液比為1/3，1/4，1/5（W/V）和NaOH濃度為2%，3%，4%下進(jìn)行。表1顯示了實(shí)驗(yàn)條件為β-葡聚糖的提取啤酒廢酵母泥300g，其中含有78.42%的水分?；旌虾罄鋮s到室溫，不溶性殘留物在室溫15min 5000rpm條件下被離心分離，用蒸餾水洗滌兩次。丟棄上清液和收集沉淀物。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

（2）蛋白酶處理

堿處理后用不同的酶酶解，目的是降低蛋白質(zhì)含量和純化多糖。用水稀釋得到的懸浮液含有15%（W/W）的固體含量。分別用木瓜蛋白酶（P1），復(fù)合酶（P2）和中性蛋白酶（N）在各自的最佳條件酶解后，懸浮液5000rpm離心10min。丟棄上清液，收集濕產(chǎn)物。

（3）洗滌和干燥

濕β-D-葡聚糖懸浮在95%乙醇混懸液中攪拌3h，然后離心棄上清。用乙醇沖洗兩遍，在60℃下干燥。

1.3.5 提取甘露聚糖

（1）濃度

在50℃-60℃下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（re-52，中國(guó)上海中國(guó)生化儀器廠）超濃縮至原體積的1/2-1/3。完成后溶液冷卻至室溫。

（2）透析

在室溫條件下，對(duì)蒸餾水透析適當(dāng)時(shí)間后測(cè)定溶液鹽度。

（3）脫水

濃縮的溶液滴加三倍體積的乙醇攪拌，然后儲(chǔ)存在4℃下超過(guò)10h。

（4）洗滌和干燥

用乙醇沉淀數(shù)次直到上清液透明，甘露聚糖真空過(guò)濾，并在60℃下干燥。收集的甘露聚糖是白色無(wú)定形粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理

預(yù)處理會(huì)損失去一部分多糖，所以洗兩次是最好的。通過(guò)物理或者化學(xué)的方法使完整的酵母通過(guò)自溶和滲透來(lái)提取酵母內(nèi)容物[14]。葡聚糖和甘露聚糖產(chǎn)量如表2所示。

經(jīng)過(guò)高溫高壓處理，將混合物離心。這個(gè)過(guò)程可以有效地分離甘露糖蛋白和葡聚糖。此外，高溫高壓處理能顯著降低細(xì)胞壁[16]的機(jī)械強(qiáng)度，這可能有助于下酶解。

表2 分別處理葡聚糖和甘露聚糖中固體含量和化學(xué)成分

表3 正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2 β-D-葡聚糖的分離

2.2.1 堿處理

工藝中氫氧化鈉可以去除一些不需要的成分如蛋白質(zhì)，脂類和多糖。溫度，提取時(shí)間，料液比、NaOH濃度通常被認(rèn)為是最重要的因素。優(yōu)化的β-D-葡聚糖提取合適的提取條件可通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。表3顯示了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)堿提取結(jié)果的影響。因此，表4列出了K，k、R值。

表4 L9(34)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)表4中R的數(shù)值，以碳水化合物及粗蛋白平均百分比的影響分別是：B＞A＞D＞C，Affgt;Dffgt;Cffgt;B。由于蒸餾水相對(duì)便宜，所以增加料液比有助于去除其他雜質(zhì)，因此，我們選擇C2為適用條件。NaOH濃度（因子）的確定的粗蛋白含量和高濃度堿易造成多糖[17-20]降解，因此適用條件是D2。對(duì)于葡聚糖提取過(guò)程的最優(yōu)參數(shù)組合為A3B2C2D2。即，提取溫度，提取時(shí)間，料液比、NaOH濃度分別為60℃，3h，1/4，和3%。

2.3 甘露聚糖提取

2.3.1 濃度與透析

上清液（SUP）經(jīng)過(guò)高溫高壓處理后收集，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。由于SUP含有大量的鹽，如果超濃縮過(guò)度，鹽從溶液中析出，造成多糖的損失，因此，2-3倍是適當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

經(jīng)過(guò)蒸餾水透析一段時(shí)間，鹽從溶液中滲透到蒸餾水中。以碳水化合物和灰分的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。溶液鹽度和其中碳水化合物和灰分含量的產(chǎn)品之間的關(guān)系如圖2所示。

圖2 透析過(guò)程中鹽度對(duì)碳水化合物和灰分含量的影響

圖3 葡聚糖（G）和甘露聚糖（M）的紅外圖譜

根據(jù)分析，隨著鹽度的降低，碳水化合物和蛋白質(zhì)都相應(yīng)增加，灰分減少，即在產(chǎn)品中的活性成分增加。如圖所示，灰分隨著鹽度的變化不斷減少。但是，鹽度的變化從1.81%到0.06%，9h內(nèi)灰分下降僅為0.17%，不利于工業(yè)化發(fā)展。因此，溶液的適宜鹽度為0.8%～1.2%。

2.4 產(chǎn)物定性

2.4.1 紅外檢測(cè)

在3384cm-1/3397cm-1，2932cm-1/2922cm-1，1644cm-1/1637cm-1處有明顯的吸收帶，分別是-OH，C-H鍵和C=O拉伸吸收峰。在1200cm-1-950cm-1的是C-O振動(dòng)吸收峰。最重要的約891cm-1處的吸收帶說(shuō)明葡聚糖是β-構(gòu)型，845cm-1處是α-吡喃環(huán)[21]端基異構(gòu)體形式。在811cm-1和912cm-1處的特殊吸收說(shuō)明M是α-甘露聚糖[22]，這從他們的單體單元和葡聚糖的特征譜帶在1157cm-1，1078cm-1，1040和891cm-1處，這表明鏈接為β構(gòu)型。因此，說(shuō)明產(chǎn)物是β-D-葡聚糖和α-甘露聚糖。如圖3所示。

3 結(jié)論

新方法在超聲處理后采用高溫高壓法分離β-D-葡聚糖和甘露聚糖。β-D-葡聚糖通過(guò)堿處理和蛋白酶降解法純化，而甘露聚糖的制備則通過(guò)以下步驟包括濃縮、透析、沉降制備。此外，還驗(yàn)證了濃縮液鹽度和多糖、灰分和沉降速率的關(guān)系，最終確定了整個(gè)工藝的最優(yōu)鹽度。

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