王超，何梓鈺，査應(yīng)洪，楊淑儀，杜冰

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

2(紅河群鑫石斛種植有限公司，云南紅河，661200)

石斛屬植物，按形態(tài)、產(chǎn)地等可分為鐵皮、金釵、黃草、霍山等數(shù)十個品種，其中以鐵皮石斛最為珍貴。鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥莖［1］，因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛含有大量的活性物質(zhì)，主要為石斛多糖［2］、石斛堿［3］、類黃酮、氨基酸、芪類及其衍生物以及多種揮發(fā)性成分［4］，除具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力［5］等作用，還具有擴(kuò)張血管、降低血壓［6］之功效。鐵皮石斛除可鮮食外，還可燉湯、泡茶和浸酒［7］。通常加工成干品，如鐵皮楓斗［8］。此外，還可制成功能性飲料［9］。本文選用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別接種發(fā)酵石斛汁。制成的石斛汁乳酸飲料不僅較好地保存了營養(yǎng)物質(zhì)，而且綜合了乳酸發(fā)酵的優(yōu)點，集石斛汁精華與乳酸菌的功能性于一體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛:購于紅河群鑫石斛種植有限公司。

乳酸菌種:植物乳桿菌(Lp-115)、鼠李糖乳桿菌(LR-54)、凝結(jié)芽孢桿菌(TQ-33)，本實驗室保存。

MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH S-25型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA1104N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;JM-L50膠體磨，上海斯邁克輕工設(shè)備廠;YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;GHX-9270 B-2隔熱式恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪試驗設(shè)備有限公司;101-2S4電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海迅能電熱設(shè)備有限公司;打漿機(jī)，美的集團(tuán)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 石斛汁的制備

取新鮮鐵皮石斛莖，用清水洗凈，切成小段，文火煮沸10 min后趁熱打漿，漿水后用膠體磨研磨，分別進(jìn)行粗磨和細(xì)磨各1次。

1.3.2.2 石斛汁加熱殺菌

在90℃，10～15 min下滅菌，以殺滅石斛汁中有害微生物。

1.3.2.3 接種、發(fā)酵和冷藏

將滅完菌的石斛汁冷卻至40℃以下，接入乳酸菌發(fā)酵劑，在37℃恒溫發(fā)酵48 h后置于4℃冰箱中冷藏。

1.3.3 測定指標(biāo)與測定方法

pH值用采用pH S-25型酸度計測定;總酸的測定采用電位滴定法［11］(以乳酸計);還原糖的測定采用直接滴定法［12］;氨基態(tài)氮的測定采用甲醛值法測定［13］;乳酸菌活菌數(shù)采用平板計數(shù)法［10］測定，參考GB/T 4789.35-2010。

1.3.4 感官評價指標(biāo)

感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1，相關(guān)評價方法參考 GB/T 12315-2008。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Standards of sensory evaluation

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化規(guī)律

將凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌分別接入石斛汁中進(jìn)行對比發(fā)酵，接入的初始活菌數(shù)約為7.08 lg(CFU/mL)，接種開始記為0 h，在發(fā)酵過程中間隔取樣，分別測定3種石斛汁中的活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化Fig.1 Change of viable cell count in fermentation

從圖1可以看到，3種乳酸菌在發(fā)酵過程經(jīng)歷了短暫的延遲期，延遲期的長短與菌種、菌齡、培養(yǎng)條件等密切相關(guān)［15］。凝結(jié)芽孢桿菌延遲期較短，很快進(jìn)入對數(shù)生長期。菌體數(shù)目呈幾何級增長，并且凝結(jié)芽孢桿菌在對數(shù)期的增長速度相比另外兩種菌要快。第12 h左右開始進(jìn)入穩(wěn)定期，由于營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及pH值的降低，凝結(jié)芽孢桿菌的繁殖率和死亡率趨于平衡，至發(fā)酵結(jié)束時活菌數(shù)基本不變，第48h時活菌數(shù)達(dá)到9.47 lg(CFU/mL)。鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌分別在12、18 h時左右進(jìn)入穩(wěn)定期，至發(fā)酵結(jié)束時活菌數(shù)分別為9.33、8.95 lg(CFU/mL)。與0h的活菌數(shù)相比，凝結(jié)芽孢桿菌增加的數(shù)量是3種菌株中最高的，從7.08 lg(CFU/mL)增長至9.47 lg(CFU/mL)，表明其在石斛汁中具有優(yōu)良的增值活性。

2.2 發(fā)酵過程中總酸變化規(guī)律

接種開始計為0 h，在發(fā)酵過程中進(jìn)行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中總酸的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵過程酸度的變化Fig.2 Change of acid degree in fermentation

由圖2可以看出，3種乳酸菌發(fā)酵石斛汁的總酸含量在0～6 h時均緩慢增加，隨后迅速上升，第36 h之后無顯著變化，至發(fā)酵結(jié)束時，凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵石斛汁的乳酸含量分別為7.85、6.93、7.66 mg/mL。這是因為經(jīng)過短暫的適應(yīng)期后，乳酸菌利用石斛汁中的糖分作為碳源，通過代謝產(chǎn)生大量乳酸，但由于石斛汁中可供乳酸菌利用的碳氮源有限，發(fā)酵后期乳酸菌產(chǎn)酸速度降低。從產(chǎn)酸能力和速率來說，凝結(jié)芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌差別不大，而兩者要優(yōu)于植物乳桿菌。

2.3 發(fā)酵過程中pH值變化規(guī)律

接種開始計為0h，在發(fā)酵過程中進(jìn)行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中pH值的變化情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.3 Change of pH value in fermentation

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，石斛汁的pH值不斷下降，這主要是乳酸菌產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)的緣故。發(fā)酵開始時，由于凝結(jié)芽孢桿菌需要適應(yīng)新環(huán)境，產(chǎn)酸較少，這一時期石斛汁的pH值變化不明顯。6 h之后，凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期，石斛汁的pH值迅速下降，至第12 h，pH值由5.84下降至4.23。植物乳桿菌在發(fā)酵開始時由于產(chǎn)酸較少，pH值下降緩慢，6 h之后石斛汁的pH值下降速度加快，至第18 h，pH值由5.93下降至4.08。鼠李糖乳桿菌從第6h左右進(jìn)入對數(shù)期，產(chǎn)酸趨勢開始明顯，第36 h之后，由于產(chǎn)酸速度放緩，pH值呈緩慢下降的趨勢。

2.4 發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮的變化規(guī)律

接種開始計為0 h，在發(fā)酵過程中進(jìn)行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中氨基態(tài)氮含量的變化情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮的變化Fig.4 Change of amino nitrogen in fermentation

從圖4可以看出，3種乳酸菌在發(fā)酵石斛汁的過程中氨基態(tài)氮含量的變化不顯著，但不同乳酸菌對蛋白質(zhì)的利用情況有一定差別。由于乳酸菌缺乏合成幾種必需氨基酸的能力，故乳酸菌須通過蛋白酶系降解生長環(huán)境中的蛋白質(zhì)，主要通過菌體細(xì)胞壁蛋白酶和肽酶的分解作用獲得游離氨基酸和多肽［14］。凝結(jié)芽孢桿菌在發(fā)酵前期的氨基態(tài)氮含量比發(fā)酵后期高，而植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮的含量無明顯變化?？赡苁怯捎谀Y(jié)芽孢桿菌分解蛋白質(zhì)和利用氨基酸的能力比植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的強(qiáng)，所以凝結(jié)芽孢桿菌在發(fā)酵前期分解蛋白質(zhì)得到較多的多肽和游離氨基酸，在發(fā)酵后期利用的量也比另兩種菌多。

2.5 發(fā)酵過程中還原糖的變化規(guī)律

接種開始記為0 h，在發(fā)酵過程中進(jìn)行間隔取樣，分別測定3種石斛汁中的還原糖含量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵過程中還原糖的變化Fig.5 Change of reducing sugar in fermentation

從圖5可以看到，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，石斛汁內(nèi)的還原糖不斷被消耗。在發(fā)酵前期，乳酸菌消耗還原糖速率較快，至發(fā)酵后期，還原糖含量消耗速度緩慢，這與發(fā)酵后期酸度變化情況相對應(yīng)。此外，不同菌種在發(fā)酵過程中對石斛汁中還原糖的利用情況存在差異，植物乳桿菌消耗糖的速率要低于凝結(jié)芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌。在未添加任何碳氮源的前提下，發(fā)酵48 h后，植物乳桿菌發(fā)酵石斛汁中的還原糖含量減少了67.28%，凝結(jié)芽孢桿菌與鼠李糖乳桿菌發(fā)酵石斛汁中還原糖含量分別減少了78.64%、76.85%。

3 結(jié)論

(1)在乳酸菌發(fā)酵石斛汁的過程中，凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌都存在延遲期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。其中，凝結(jié)芽孢桿菌的延遲期最短，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，從第12 h便進(jìn)入穩(wěn)定期，至發(fā)酵結(jié)束活菌數(shù)為9.47 lg(CFU/mL)。植物乳桿菌的延遲期較長，從第6 h起進(jìn)入對數(shù)生長期，第18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，至發(fā)酵結(jié)束活菌數(shù)為8.95 lg(CFU/mL)。

(2)發(fā)酵石斛汁過程中，由于乳酸菌不斷利用其中的可發(fā)酵糖生成乳酸等酸性物質(zhì)，pH值不斷降低，酸度不斷增加。發(fā)酵48 h后，植物乳桿菌發(fā)酵石斛汁的乳酸含量為6.93 mg/mL，凝結(jié)芽孢桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵石斛汁的乳酸含量分別為7.85、7.66 mg/mL。從3種乳酸菌在發(fā)酵石斛汁過程中的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸能力來說，凝結(jié)芽孢桿菌略優(yōu)于鼠李糖乳桿菌，鼠李糖乳桿菌優(yōu)于植物乳桿菌。

(3)在未添加其他碳氮源的條件下，發(fā)酵48 h后，植物乳桿菌發(fā)酵石斛汁中的還原糖含量減少了67.28%，凝結(jié)芽孢桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵石斛汁中還原糖含量分別減少了78.64%、76.85%。

(4)對3種乳酸菌發(fā)酵所得石斛汁進(jìn)行感官評價，分析評價的指標(biāo)有口感、色澤、香氣及組織狀態(tài)，各指標(biāo)的評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。感官評價總分為口感評分、色澤評分、香氣評分和組織狀態(tài)評分之和。共有20位有品嘗經(jīng)驗的老師和研究生作為評價員對發(fā)酵石斛汁進(jìn)行感官評價，凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵石斛汁的感官評價最終結(jié)果依次為84分、75分、89分。綜合產(chǎn)酸速度、還原糖利用率、活菌數(shù)、產(chǎn)品感官等指標(biāo)考慮，確定發(fā)酵菌種為鼠李糖乳桿菌。

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