錢(qián) 鐳 ， 任德財(cái) ， 韓春然 ， 張 娜 ， 劉 穎 ， 馬永強(qiáng) *

（1.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase；EC2.3.2.13；全稱(chēng)為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶）是一種能催化多肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(tuán)（?；墓w）與許多伯胺化合物（?；荏w）之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶[1-2]。蛋白質(zhì)經(jīng)TG改性后其凝膠特性、粘性、持水性、水溶性和熱穩(wěn)定性等功能特性都會(huì)得到一定程度的改善[3-4]，另外還可保護(hù)食品中的賴(lài)氨酸免受各種加工過(guò)程的破壞。同時(shí)由于反應(yīng)過(guò)程中有谷氨酸的生成，在一定程度上還可改善食品的風(fēng)味。但是游離酶因穩(wěn)定性差、難以回收、易混入產(chǎn)品和不易循環(huán)利用等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到限制。通過(guò)物理或化學(xué)的方法將酶固載于載體后可以克服游離酶的弱點(diǎn)。固定化酶不僅保留了游離酶原有的活性及高度選擇性，而且克服了游離酶催化反應(yīng)不便于連續(xù)化和自動(dòng)化的缺點(diǎn)，因而具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

聚丙烯膜由于具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，易于控制的微孔結(jié)構(gòu)以及制備方便等特點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。然而，其化學(xué)惰性的表面也為酶固定化帶來(lái)了困難。通過(guò)接枝聚合，進(jìn)而共價(jià)結(jié)合酶分子，是聚丙烯膜固定化酶的一種有效手段。

通過(guò)紫外光引發(fā)甲基丙烯酸甲酯的接枝聚合，在聚丙烯微孔膜表面引入反應(yīng)性官能團(tuán)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在化學(xué)惰性聚丙烯膜上的共價(jià)固定化，優(yōu)化了接枝反應(yīng)和固定化條件，得到一種比較理想的酶晶體膜固定化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶晶體：實(shí)驗(yàn)室自制；聚丙烯微孔膜：北京升河誠(chéng)信膜科技發(fā)展中心產(chǎn)品；甲基丙烯酸甲酯（化學(xué)純）：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠(chǎng)產(chǎn)品；1，6-己二胺（化學(xué)純）：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠(chǎng)產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷（tris）：北京北實(shí)縱橫科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；還原型谷胱甘肽：sigma 公司產(chǎn)品；N-α-CBZ-Gln-Gly：sigma 公司產(chǎn) 品 ；L-Glutamic acid γ -monohydroxamic acid：sigma公司產(chǎn)品；鹽酸羥胺（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外光引發(fā)裝置（500W）：實(shí)驗(yàn)室自制；空氣振蕩器（HEQ-C）：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱（ZK-82B）：上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠(chǎng)產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Spectrum722E型）：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甲基丙烯酸甲酯在膜表面的紫外接枝方法

1）聚丙烯微孔膜的預(yù)處理 將聚丙烯膜（孔徑10 μm）置于丙酮中浸泡24 h，于真空干燥箱中30℃干燥24 h，儲(chǔ)存于干燥器中備用。

2）預(yù)照射 先配制0.2 mol/L光敏劑二苯甲酮的丙酮溶液，將已稱(chēng)重（W0）的處理過(guò)的膜浸入溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用紫外光照射一段時(shí)間，取出膜于空氣中自然晾干，備用。

3）第二步光照 再將上述膜浸入到含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用紫外光照射一段時(shí)間后，將膜取出，用大量乙醇沖洗。再將膜浸入丙酮中，于30℃水浴振蕩器中振蕩24 h，期間每4h更換一次丙酮溶劑，將膜表面殘留的單體及均聚物徹底洗脫。清洗過(guò)的膜于真空干燥箱中30℃干燥24 h，稱(chēng)重（W）。甲基丙烯酸甲酯在膜表面的接枝率（GD）按下式計(jì)算：

1.3.2 紫外接枝反應(yīng)條件優(yōu)化 采用預(yù)照射時(shí)間為12 min，研究照射距離、單體濃度和二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的影響。

1）單因素試驗(yàn) 第一組控制照射距離為4，6，8，10，12，16 cm 進(jìn)行單因素試驗(yàn)， 研究照射距離對(duì)接枝率的影響；第二組將甲基丙烯酸甲酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別配制成 5%，10%，15%，20%，25%，30%，研究單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)接枝率的影響；第三組設(shè)定二次照射時(shí)間為 5，10，15，20，25，30 min，研究二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的影響。

2）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素的結(jié)果，采用響應(yīng)面Box-Benhken中心組合設(shè)計(jì)，以接枝率為響應(yīng)值，以照射距離（A）、單體濃度（B）、二次照射時(shí)間（C）為自變量，設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水品編碼見(jiàn)表1。

1.3.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定化方法

1）己二胺間隔臂的引入 將己二胺溶解于去離子水中配成一定濃度的溶液，甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入己二胺溶液中，于空氣振蕩器上在一定溫度下振蕩一定時(shí)間。取出膜，用大量去離子水沖洗以除去吸附于膜上的己二胺?？疾炝思憾窛舛龋憾坊罨瘻囟?，己二胺活化時(shí)間對(duì)固定化酶晶體活力的影響。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

2）戊二醛交聯(lián) 將己二胺處理過(guò)的膜浸入戊二醛水溶液中，于空氣振蕩器上在30℃下振蕩一定時(shí)間。取出膜，用大量去離子水沖洗活化后的膜即可?？疾炝宋於舛?、交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶晶體活力的影響。

3）酶的固定化 試驗(yàn)所用的酶為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的交聯(lián)酶晶體，酶活力為102.8 U/mg。將表面活化的平板膜剪成3 cm×3 cm的小片，取一定數(shù)量的接枝膜浸入10 mL預(yù)處理過(guò)的酶晶體溶液中，于4℃下反應(yīng)若干小時(shí)。將膜取出，用大量醋酸鹽緩沖液（0.03 mol/L，pH 6.0）沖洗，以除去表面黏附的酶液。將固定化酶晶體膜浸入醋酸鹽緩沖液 （0.03 mol/L，pH 6.0）中，于4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

在此過(guò)程中，主要考察指標(biāo)：酶晶體溶液濃度分別在 5，10，15，20，25 mg/mL 時(shí)對(duì)固定化酶晶體活力的影響情況。不同的固定化酶晶體反應(yīng)時(shí)間（6，12，18，24，30，36 min）時(shí)對(duì)固定化酶晶體活力的影響情況。

1.3.4 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的測(cè)定 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性采用Folk和Cole報(bào)導(dǎo)的分光Hydroxamate分析法測(cè)定[8-9]。試劑A：含0.2 mol/L tris-HCl緩沖液（pH=6.0），0.1 mol羥胺，0.01 mol還原型谷胱甘肽及0.03 mol/L N-α-CBZ-Gln-Gly的混合液；試劑B：3 mol/L HCl， 三氯乙酸及質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%FeCl3·6H2O（溶解于0.1 mol/L HCl中）等體積混合。試劑A在37℃與酶液反應(yīng)10 min后，添加B終止酶反應(yīng)并形成紅色鐵化合物，8 000 r/min離心5 min除去沉淀，上清液于525 nm測(cè)定吸光度，用L-谷氨酸γ-單羥肟酸 （L-Glutamic acid γ-monohydroxamic acid）做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。1單位TGase酶活力單位定義為：37 ℃每分鐘催化 1 μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸所需酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外接枝反應(yīng)條件對(duì)接枝率的影響

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著光照距離的增加，接枝率也隨之增加，當(dāng)光照距離增加到10 cm時(shí)，接枝率基本上達(dá)到了最大，而繼續(xù)增加光照距離之后，接枝率有所下降，故試驗(yàn)中光照距離定為10 cm。甲基丙烯酸甲酯的濃度對(duì)于膜的接枝率具有較大的影響，當(dāng)甲基丙烯酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，單體接枝率最大，而隨著單體濃度的持續(xù)增加，接枝率沒(méi)有太大明顯的變化，所以，在試驗(yàn)中將甲基丙烯酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)定為20%。第二步接枝反應(yīng)時(shí)間會(huì)明顯地影響接枝率，隨著時(shí)間的增加，單體接枝率逐漸升高，在5～15 min內(nèi)，接枝率的增幅較大。直至20 min左右達(dá)到接枝率最大值。同時(shí)，光照時(shí)間不可太長(zhǎng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使單體溶液烤干，不利于單體的接枝，因此，二次光照的時(shí)間選擇20 min為宜。

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design Expert對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，獲得接枝率對(duì)照射距離、單體濃度以及二次照射時(shí)間的二次回歸方程：

GD=34.50-0.030A-0.99B+0.53C-0.47AB+0.24AC-0.60BC-1.52BD-1.32A2-2.58B2-1.19C2

2.1.3 多元回歸模型分析 對(duì)擬合的二次多次多項(xiàng)式中3個(gè)自變量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3方差分析可知，模型P值（0.000 2）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，此時(shí)回歸方差模型是高度顯著的，因此這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。決定系數(shù)R2=0.967 0，說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of fiited regression model

三因素之間的交互作用見(jiàn)圖1～3所示。當(dāng)二次照射時(shí)間為20 min時(shí)，單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和照射距離對(duì)接枝率的影響見(jiàn)圖1，當(dāng)單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，接枝率隨著照射距離的增加而先增大后減小。當(dāng)照射距離不變時(shí)，隨著甲基丙烯酸甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，接枝率也逐漸增大，當(dāng)單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，接枝率開(kāi)始下降。

當(dāng)單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，照射距離和二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的交互影響見(jiàn)圖2。當(dāng)照射距離不變時(shí)，接枝率隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而先增加后減少，照射時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，接枝率為最大。當(dāng)照射時(shí)間不變時(shí)，隨著照射距離的增加，接枝率也增大，當(dāng)照射距離為10 cm時(shí)，接枝率開(kāi)始下降。

圖1 單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和照射距離對(duì)接枝率的影響Fig.1 Effect of cross-interaction between distance of ultraviolet and consistency of methyl -methacrylate

圖2 照射距離和二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的影響Fig.2 Effect of cross-interaction between distance of ultraviolet and time of ultraviolet

當(dāng)照射距離為10 cm時(shí)，單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的交互影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，接枝率隨著照射時(shí)間的增加而增大，照射時(shí)間為25 min時(shí)，接枝率達(dá)到最大。當(dāng)照射時(shí)間不變時(shí)，隨著單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，接枝率也逐漸增大，當(dāng)單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，接枝率達(dá)到最大，隨著濃度繼續(xù)增大，接枝率逐漸下降。

2.1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 軟件提供的最佳接枝反應(yīng)條件如下：照射距離為10.1 cm、單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.85%、二次照射時(shí)間為21.4 min。進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)的平均接枝率為34.62%，這與理論預(yù)測(cè)值34.688 5比較接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的紫外接枝反應(yīng)條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，按照建立的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)在實(shí)踐中是可行的。

圖3 單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和二次照射時(shí)間對(duì)接枝率的影響Fig.3 Effect of cross-interaction between consistency of methyl-methacrylate and time of ultraviolet

2.2 固定化條件對(duì)酶活性的影響

2.2.1 己二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性的影響如圖4所示，隨著己二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶的活性也在增加，但當(dāng)己二胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)20%之后時(shí)，酶活性趨勢(shì)沒(méi)有了太大的變化，說(shuō)明這一質(zhì)量分?jǐn)?shù)已足夠使胺烷基化反應(yīng)進(jìn)行完全。因此，己二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般控制在20%。

圖4 己二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性的影響Fig.4 Effect of consistency of hexamethylendiamine on the relative activity of transglutaminase

2.2.2 胺烷基化溫度對(duì)固定化酶活性的影響 如圖5所示，隨著胺烷基化溫度的升高，酶的活性也有所增加，當(dāng)溫度大于50℃時(shí)，酶活性受到了影響并有明顯的下降。因此，50℃為胺烷基化的最佳溫度。

2.2.3 胺烷基化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響 如圖6所示，隨著胺烷基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性在持續(xù)增加，當(dāng)反應(yīng)到90 min時(shí)，酶活性最高，并且隨著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加，酶活性受到了影響，但下降的趨勢(shì)不明顯。因此，在試驗(yàn)中，胺烷基化反應(yīng)時(shí)間控制在90 min。

圖5 胺烷基化溫度對(duì)酶活性的影響Fig.5 Effect of amine alkylation temperature on the relative activity of transglutaminase

圖6 胺烷基化反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.6 Effect of amine alkylation time on the relative activity of transglutaminase

2.2.4 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活性的影響選擇了體積分?jǐn)?shù)1%～3%的戊二醛溶液進(jìn)行研究，如圖7可知，戊二醛的體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力影響程度不大，而且當(dāng)戊二醛的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時(shí)，酶活有所減少，而當(dāng)酶活在2%時(shí)，相對(duì)酶活較高，綜合各方面因素考慮，將戊二醛體積分?jǐn)?shù)確定在2%。

圖7 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活性的影響Fig.7 Effect of consistency of glutaraldehyde on the relative activity of transglutaminase

2.2.5 戊二醛作用時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響如圖8所示，戊二醛活化時(shí)間對(duì)固定化酶活性影響不大，在40 min時(shí)，酶活相對(duì)較高，而在40 min之后酶活性也受到一些影響而下降，可能是由于戊二醛與酶分子上的氨基化學(xué)鍵合后，使得酶的構(gòu)象發(fā)生變化從而降低了活性[10]。故將戊二醛活化時(shí)間確定在40 min。

圖8 戊二醛作用時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.8 Effect of reaction time of glutaraldehyde on the relative activity of transglutaminase

2.2.6 酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響 酶溶液濃度對(duì)酶活性的影響如圖9所示。隨著酶溶液濃度的增加，酶活力也增強(qiáng)，當(dāng)酶溶液質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，酶活力達(dá)到最大，當(dāng)酶溶液濃度繼續(xù)增加，酶活力沒(méi)有太大的變化，這說(shuō)明，在15 mg/mL的酶溶液中，酶分子把戊二醛所暴露出的可偶聯(lián)的位點(diǎn)全部占有，使酶活性達(dá)到最大；而當(dāng)酶質(zhì)量濃度超過(guò)15 mg/mL的酶晶體溶液中的酶分子沒(méi)有完全占有戊二醛的偶聯(lián)位點(diǎn)，剩余的酶無(wú)法與戊二醛進(jìn)一步結(jié)合，故酶活力沒(méi)有明顯的變化。因此，在實(shí)驗(yàn)中將酶晶體溶液的質(zhì)量濃度確定在15 mg/mL。

圖9 酶質(zhì)量濃度對(duì)酶活性的影響Fig.9 Effect of consistency of enzyme on the relative activity of transglutaminase

2.2.7 酶固定化反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響 由于酶晶體在4℃的低溫下保存，酶活力幾乎沒(méi)有影響，所以為防止酶晶體在固定化過(guò)程中失活，酶晶體固定化反應(yīng)均在4℃的低溫下進(jìn)行，因此固定化的速度較慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)。固定化時(shí)間對(duì)酶活性的影響如圖10所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，聚丙烯微孔膜上固定酶晶體數(shù)量增多，酶活性變大。當(dāng)固定24 h之后，反應(yīng)接近完全，酶活性沒(méi)有太大的變化。因此，在試驗(yàn)中酶固定化反應(yīng)時(shí)間控制在24 h。

圖10 固定化時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.10 Effect of immobilized time on the relative activity of transglutaminase

3 結(jié) 語(yǔ)

采用紫外光照射接枝的方法在聚丙烯膜表面接枝甲基丙烯酸甲酯單體，通過(guò)響應(yīng)面分析得到最佳接枝條件為：照射距離為10.1 cm、單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.85%、二次照射時(shí)間為21.4 min。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶固定化的條件為：己二胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，胺烷基化時(shí)間90 min，胺烷基化溫度50℃；戊二醛體積分?jǐn)?shù)2%，戊二醛作用時(shí)間40 min；酶質(zhì)量濃度15 mg/mL，4℃條件下固定化時(shí)間24 h，可以得到較高的酶活。

[1]Motoki M，Seguro K.Tranglutaminase and its use for food processing[J].Trend Food Sci Technol，1998（9）：204-210.

[2]宮俊，崔莉，范雪榮，等.基于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化交聯(lián)的羊毛角蛋白成膜性能的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（6）：615-620.GONG Jun，CUI Li，F(xiàn)AN Xuerong.Study on filming performance of wool keratin with the catalvsis of transglutaminase[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（6）：615-620.（in Chinese）

[3]Chiya Kuraishi，Katsutoshi Yamazak，i and Yasuyuki Susa.Transglutaminase：its utilization in the food Industry[J].Food Reviews International，2001，17（2）：221-246.

[4]丁克毅.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性明膠強(qiáng)度薄膜的制備[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26（1）：25-28.DING Keyi.Enhanced films prepared from microbial transglutaminase modified gelatin[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007，26（1）：25-28.