李 樂 ， 聶靜苑 ， 彭新凱 ， 李 林 ， 何剪太

（1.中南大學 衛(wèi)生部肝腸膽外科研究中心，湖南 長沙410008；2. 長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南長沙 410013）

近年來，病原菌在全球范圍內(nèi)的肆掠，造成了廣泛的關注。數(shù)千種病原菌已經(jīng)被證實對人類具有明顯的危害作用，包括感染、食物中毒以及各種免疫反應。

金黃色葡萄球菌是一種葡萄狀排列的革蘭陽性球菌，該細菌能夠造成人類皮膚感染、肺炎、腦膜炎以及嚴重的食物中毒等狀況。有報道顯示20%的人群長期攜帶該種細菌[1]。當前在食品檢測以及醫(yī)療領域，金黃色葡萄球菌的檢測一般都基于常規(guī)的生化培養(yǎng)方法，時間3～5 d。因此如何減少檢測時間成為擺在食品監(jiān)督以及醫(yī)療衛(wèi)生領域的一大難題。

近幾年，各種關于金黃色葡萄球菌在臨床醫(yī)療以及食品安全領域快速檢測的新方法不絕于耳，相關基礎研究工作也在不斷的推進，包括基于納米顆粒的免疫層析法[2]，表面增強生物傳感器[3]核苷酸鏈式反應結合酶免反應檢測金黃色葡萄球菌的腸毒素A基因[4]，環(huán)介導恒溫擴增法檢測金黃色葡萄球菌，以及商業(yè)化API試劑盒以及金黃色葡萄球菌測試片等實驗室基礎研究工作。雖然這些新型的方法較傳統(tǒng)的方法能夠縮短時間，但由于該類方法的重復性較差，阻礙了其在現(xiàn)實工作中的推廣。因此，研究并開發(fā)一種能夠運用到實際工作中檢測金黃色葡萄球菌的檢測體系，已成為擺在各類專業(yè)技術人員面前的新課題和迫切需要。

分子信標是一種特異的DNA序列結構其中莖部結構由兩個互補序列結合雜交而成。一個熒光基團標記在一條序列的一頭，而另一頭則標記一個淬滅基團。由于熒光基團與淬滅基團的距離很近，熒光信號被淬滅而不被激發(fā)。這種特殊的基因機構在很多領域具有運用[5-14]。在作者的研究中，擬借用這樣的獨特結構，借助ATMND染料結合在核苷酸缺失位點中，同時，利用ATMND互補的C堿基能夠淬滅該染料的熒光而暫時失去熒光信號的特點，設計出新奇的檢測方法。這種方法針對金黃色葡萄球菌序列并結合分子信標的環(huán)狀互補序列，同時在分子信標的莖部設計基因缺失位點，讓ATMND染料能夠嵌入且被互補的C堿基淬滅。由于ATMND染料能夠自動插入缺失位點，并被C堿基淬滅，因此當雜交目標序列被混入探針溶液后，莖環(huán)結構的構象將發(fā)生根本改變，分子信標變成打開狀態(tài)。ATMND染料也遠離了C堿基，熒光信號被重新恢復。因此通過檢測熒光強度就能客觀反應目標DNA的存在。這種利用ATMND無標記探針方法已經(jīng)成功的在腺苷、Pb2+、UO2、Hg2+的檢測[15-18]中有所使用。當然，這樣的獨特的結構與設計方法與傳統(tǒng)的分子信標方法檢測比較，大幅地降低了檢測成本。作者將不同濃度的金黃色葡萄球菌DNA與設計獨特的分子信標探針進行雜交，以獲得金黃色葡萄球菌DNA與分子信標探針熒光恢復的比例狀況，同時驗證該分子信標探針以及結合體系與對金黃色葡萄球菌DNA是否存在相關特異性。為將來該方法真正用于金黃色葡萄球菌的檢測工作中奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ATMND：美國RYAN科技公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒：鼎國生物產(chǎn)品；半固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物技術有限公司產(chǎn)品；腦心浸液：廣東環(huán)凱生物技術有限公司產(chǎn)品；DNA序列由上海生工生物有限公司合成，序列可以參看表1。其他的試劑均為分析純試劑并未進行其他純化和改變。所有的實驗用水均使用雙蒸水進行。

表1 DNA序列列表Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this work

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基 陽性標準菌株為金黃色葡萄球菌 （ATCC6538），陰性菌株為阪崎腸桿菌（ATCC2900）、大腸埃希菌（ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、單核細胞增生李斯特菌（CMCC（B）54002）、沙門氏菌（CMCC（B）50115）。 所有的細菌均保存于4℃，半固體培養(yǎng)基中。所有的菌種復蘇以及增菌培養(yǎng)基均由腦心浸液培養(yǎng)。在整個實驗過程中所有設計細菌分離和DNA提取步驟均在生物安全柜中進行，廢物處理均為高壓滅菌鍋121℃滅菌20分鐘后丟棄。

1.1.3 主要儀器 Mastercycler：EPPEDORF公司產(chǎn)品；熒光分光光度計：F7000，日立公司產(chǎn)品。

1.2 實驗原理

作者設計了能與金黃色葡萄球菌的目標DNA雜交的含有脫堿基位點的莖-環(huán)結構，從圖1可知，在缺乏目標DNA時，ATMND與莖-環(huán)結構的脫堿基位點緊密結合，從而抑制其熒光信號。當金黃色葡萄球菌黃色葡萄球菌目標DNA加入到溶液中，其與莖-環(huán)結構DNA雜交，ATMND從D-SPACER位點釋放，從而使被猝滅的熒光信號重新恢復。這種基于ATMND染料的莖環(huán)結構基因缺失位點探針與金黃色葡萄球菌的特異DNA目標序列的檢測效果。這種探針對于金黃色葡萄球菌DNA特異性目標序列具有相當?shù)拿舾行圆⒛軌蚴沟脽晒鈴驮男Ч?/p>

圖1 ATMND熒光分子信標基因探針與黃色葡萄球菌目標DNA結合釋放熒光染料激發(fā)熒光示意圖Fig.1 Scheme of motivated fluorescence by StaphylococcusaureusDNA hybrid with stem-loop structure probe with ATMND

1.3 實驗方法

1.3.1 不同梯度金黃色葡萄球菌DNA與分子信標雜交，熒光強度恢復實驗 在離心管內(nèi)分別加入360 μL 緩 沖 液 （10 mmol/L HEPES pH 7.0，100 mmol/L NaCl和 1 mmol/L EDTA），24 μL ATMND（1 μmol/L），36 μL 莖環(huán)結構的 DNA（10 μmol/L）以及不同體積的 3，6，9，12，15，18，21，24 μL 的金黃色葡萄球菌特異性目標DNA序列（10 μmol/L），即金黃色葡萄球菌特異性目標DNA序列終濃度分別為7.09×10-2，1.41×10-1，2.10×10-1，2.78×10-1，3.45×10-1，4.11×10-1，4.76×10-1，5.41×10-1μmol/L。 漩渦震蕩后，用MASTERCYCLER加熱器對溶液進行70℃10 min變性處理，再逐步30 min內(nèi)冷卻到5℃。然后將混合液轉(zhuǎn)移到石英比色皿中，并持續(xù)控制在5℃測定。5 min后，用熒光分光光度計檢測熒光強度ex/em=358/405 nm。

1.3.2 標準菌株DNA與分子信標探針驗證該體系的特異性 在離心管內(nèi)分別加入360 μL緩沖液（10 mmol/L HEPES pH 7.0，100 mmol/L NaCl和 1 mmol/L EDTA），24 μL ATMND （1 μmol/L），36 μL莖環(huán)結構的DNA （10 μmol/L）以及不同標準菌株（金黃色葡萄球菌，阪崎腸桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌）的DNA 各 6 μL （10 μmol/L）。 漩 渦 震 蕩 后 ， 用MASTERCYCLER加熱器對溶液進行70℃10 min變性處理，再逐步30 min內(nèi)冷卻到5℃。然后將混合液轉(zhuǎn)移到石英比色皿中，并持續(xù)控制在5℃測定。5 min后，用熒光分光光度計檢測熒光強度ex/em=358/405 nm，方法參考1.2.1。

2 結 果

2.1 金黃色葡萄球菌目標DNA的量與熒光強度的關系的探討

為了進一步評估分子信標探針的實用效果，在相同的條件下，對金黃色葡萄球菌目標DNA的量與熒光強度的關系進行研究，金黃色葡萄球菌DNA的量從 3～24 μL（10 μmol/L）逐漸增加，隨著目標DNA的量的增加，熒光強度增大，從金黃色葡萄球菌DNA 3 μmol/L的熒光強度10一直上升至金黃色葡萄球菌DNA 24 μL的990。其熒光強度隨著目標DNA的濃度增高而增強。如圖2所示。即在本實驗體系中金黃色葡萄球菌特異性目標DNA序列終濃度的檢測下限為7.09×10-2μmol/L。

圖2 金黃色葡萄球菌目標DNA的量與熒光強度的關系Fig.2 Relationship between fluorescence enhancement rateand StaphylococcusaureustargetDNA concentrations

2.2 莖環(huán)結構無標記探針與實際細菌DNA序列結合的熒光效果的測定

隨后，在相同的條件下，對不同種類的標準菌株DNA進行了探討，以驗證其分子信標探針以及體系對對金黃色葡萄球菌DNA的特異性。標準金黃色葡萄球菌菌株和其它標準陰性對照菌株DNA也同時進行了熒光檢測比較，如圖3所示。當標準金黃色葡萄球菌的DNA被加入并與探針雜交后，ATMND從缺失位點釋放，且產(chǎn)生明顯的熒光恢復信號。而其它陰性對照菌株DNA對這種探針具有不敏感或者是熒光信號恢復不強等效果。包括大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌以及沙門氏菌熒光激發(fā)不明顯。作者驗證了該分子信標探針以及實驗體系對于金黃色葡萄球菌標準菌株DNA具有一定的敏感性。為將來的實際檢測鑒定了堅實的理論和數(shù)據(jù)基礎。

圖3 熒光分光光度計檢測莖環(huán)結構無標記探針與實際細菌DNA序列結合的熒光效果Fig.3 Fluorescence spectra of stem-loop structure probhybrid with standard strains DNA

3 討 論

這種基于缺失DNA位點的分子信標探針能夠很好的利用ATMND染料的特點，結合特異性金黃色葡萄球菌目標DNA序列，通過莖-環(huán)結構的構象改變，重新激發(fā)ATMND熒光。由于熒光的強度客觀反應出目標細菌DNA量的多少，因此，這種獨特的檢測探針在測試金黃色葡萄球菌DNA的有無或者半定量上具有一定的特點和先進性。當然，實驗過程中ATMND染料具有高溫隨意進出缺失位點的特殊性，因此整個過程需要持續(xù)在5℃的溫度下進行。最后，與傳統(tǒng)的生物化學培養(yǎng)方法相比，這種技術還是具有明顯的先進性，包括在時間效率以及成本估算中占有一定額優(yōu)勢。今后，將繼續(xù)利用這種方法在未來的實際運用，包括更復雜的食品和臨床樣本環(huán)境體系，或者無需DNA提取的條件下進行基礎研究和測定工作。

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