榮 輝 ， 林祥志 *， 王龍梅 ，2

（1.國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005）

紫菜在世界上養(yǎng)殖面積大、產(chǎn)量高、技術(shù)成熟、經(jīng)濟(jì)效益好，是食用較普遍的海藻，它的保健和藥用價值已逐步為人們所接受和認(rèn)識，眾多潛在利用價值也正在被科學(xué)工作者逐步揭示[1-4]。紫菜富含人類必須的氨基酸，其他氨基酸的含量也較大且種類繁多[5-6]。紫菜氨基酸包括總氨基酸和游離氨基酸兩大類，總氨基酸由紫菜蛋白質(zhì)經(jīng)過酸、堿或酶水解而來，游離氨基酸以游離態(tài)存在于紫菜細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間，可通過浸提提取出來[7]。近些年來，隨著海藻氨基酸的廣泛應(yīng)用，氨基酸的檢測分析水平也在不斷提高。作者分別用薄層層析、離子色譜及PITC（異硫氰酸苯酯）-HPLC柱前衍生反相高效液相色譜法對壇紫菜（Porphyra haitanensis）游離氨基酸粗提液進(jìn)行檢測分析研究，并對其中一種含量較高的未知成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

壇紫菜：采自中國福建沿海，經(jīng)60℃烘箱干燥后粉碎待用。

1.2 試劑及儀器

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；PITC：異硫氰酸苯酯，Sigma公司；乙腈、正己烷、甲醇等：均為色譜純；HCl：優(yōu)級純；其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀：日本島津，LC-20A；半制備高效液相色譜儀：日本島津，LC-8A；離子色譜儀：美國戴安ICS-3000；核磁共振儀：美國Bruker，Metcurty-400；紅外光譜儀：美國 Bruker，VERTEX 70；高分辨質(zhì)譜儀：美國Waters，LCT Premier XE等。

1.3 壇紫菜游離氨基酸的分離

取一定量粉碎的壇紫菜藻粉用75%的乙醇（料液比為1∶5）浸泡24 h，然后40℃超聲提取30 min，共3次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無乙醇（40℃下），將水相用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，留水相。將水相濃縮至一定體積，過陽離子交換樹脂，收集3 mol/L氨水洗脫液，濃縮至干，用0.1 mol/L HCl定容，待檢測分析。

1.4 薄層層析

將壇紫菜游離氨基酸粗提液以展開劑正丁醇-冰乙酸-水（3∶1∶1，v/v）上行展開，取出層析板，用電吹風(fēng)吹干，噴上茚三酮乙醇溶液，注意噴灑均勻，然后置于110℃烘箱烘干顯色。

1.5 離子色譜檢測分析

色譜柱：戴安陰離子交換柱，包括分析柱（2 mm×250 mm） 和保護(hù)柱 （2 mm×50 mm）； 流速為0.25 mL/min； 進(jìn)樣量 25 μL； 柱溫為 30 ℃；250 mmol/L NaOH水溶液、1 mol/L NaAc水溶液和去離子水作為淋洗液進(jìn)行梯度淋洗。

1.6 PITC-HPLC柱前衍生反相高效液相色譜法檢測

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（5 μm×250 mm×4.6 mm）；柱溫 38 ℃；SPD-M20A 檢測器，檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。流動相A：0.1 mol/L醋酸鈉（用冰乙酸調(diào)pH值為6.5）-乙腈（體積比 97∶3）的溶液；流動相 B：乙腈-水（體積比 4∶1）的溶液。 線性洗脫程序：0.0 min，0%B；13 min，7%B；23 min，23%B；29 min，35%B；35 min，40%B；40 min，100%B；45 min，100%B；47 min，0%B。 流速為1.0 mL/min。

流動相A的配制：3 g醋酸鈉溶解在370 mL水中，用冰乙酸調(diào)至pH 6.5，加入28 mL乙腈，用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2 對照品混合溶液和樣品的衍生 取對照品混合溶液或樣品200 μL置于離心管中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈 （36 μL PITC和2.164 mL乙腈混合）溶液 100 μL，1.0 mol/L 三乙胺-乙腈（417 μL 三乙胺和2.583 mL乙腈混合）溶液100 μL，混勻，室溫下放置1 h后加入400 μL正己烷，漩渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。用移液器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

1.7 未知成分的制備分離

為確定檢測到的未知成分的結(jié)構(gòu)，采用半制備型高效液相色譜儀對衍生后的游離氨基酸粗提物進(jìn)行制備分離。收集到的目標(biāo)產(chǎn)物濃縮后，經(jīng)不加醋酸鈉的流動相再次分離，除去鹽后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去有機(jī)溶劑，再進(jìn)行冷凍干燥，收集樣品待結(jié)構(gòu)鑒定。

色 譜 柱 ：Shim-Pack PRC-ODS （20 cm×250 cm）；SPD-20A檢測器，檢測波長254 nm；進(jìn)樣量5 mL。流動相A：0.1 mol/L醋酸鈉（用冰乙酸調(diào)pH值為6.5）-乙腈（體積比 97∶3）的溶液；流動相 B：乙腈-水（體積比 4∶1）的溶液。 線性洗脫程序：0.0 min，0%B；13 min，7%B；23 min，23%B；29 min，35%B；35 min，40%B；40 min，100%B；45 min，100%B；47 min，0%B。流速為 18 mL/min。

1.8 未知成分的結(jié)構(gòu)鑒定

將制備分離到的高純化合物樣品分別進(jìn)行核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜分析以確定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜游離氨基酸的分離

壇紫菜粉末先經(jīng)乙醇超聲提取，再經(jīng)乙酸乙酯萃取，最后經(jīng)陽離子交換樹脂層析除去大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等，所收集的3 mol/L氨水洗脫組分經(jīng)茚三酮乙醇溶液顯色反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，其含有高濃度的氨基酸組分。此分離方法運(yùn)用有機(jī)溶劑和超生萃取相結(jié)合的方式，減少了提取時間，且增加了提取效果。

為篩選出一種快速、方便、準(zhǔn)確的游離氨基酸粗提液檢測分析方法，隨后分別利用薄層層析、離子色譜及PITC-HPLC三種不同檢測方法對其進(jìn)行檢測分析并進(jìn)行了比較。

2.2 薄層層析

壇紫菜游離氨基酸粗提液通過薄層層析實(shí)驗(yàn)可以看出其包含多種氨基酸，經(jīng)計算Rf值均在0.35～0.75之間，表明所選溶劑系統(tǒng)正丁醇-冰乙酸-水（體積比3∶1∶1）能較好的分離多種不同氨基酸組分，其薄層層析圖見圖1。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對比發(fā)現(xiàn)有幾種未知成分的存在。 但從圖中也可看出，由于樣品所含氨基酸種類豐富，薄層層析的分辨率有限，導(dǎo)致有些氨基酸成分并未完全分開。

圖1 壇紫菜氨基酸粗提液薄層層析圖Fig.1 Free amino acids from the crude extracts of Porphyra haitanensis by thin layer chromatography

2.3 離子色譜檢測

壇紫菜游離氨基酸粗提液經(jīng)離子色譜檢測并與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜檢測結(jié)果比較分析后，發(fā)現(xiàn)壇紫菜游離氨基酸粗提液中除含有多種組成蛋白質(zhì)的氨基酸外，還含有5種未知成分，在已知蛋白質(zhì)氨基酸中精氨酸、丙氨酸、谷氨酸的含量較高，為主要氨基酸成分。標(biāo)準(zhǔn)樣品及壇紫菜粗提樣品的離子色譜圖分別見圖2和圖3。離子色譜與薄層層析相比，分辨率、準(zhǔn)確度都較大的提高，但所用儀器昂貴、檢測費(fèi)用較高，且不能制備分離所需具體組分。

圖2 混合標(biāo)樣離子色譜圖Fig.2 Mixed standard sample of amino acids by ion chromatography

圖3 壇紫菜樣品離子色譜圖Fig.3 Chromatogram of the sample Porphyra haitanensis by ion chromatography

2.4 PITC-HPLC檢測

2.4.1 檢測結(jié)果 壇紫菜游離氨基酸粗提液通過與混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜比較分析發(fā)現(xiàn)，其中除了組氨酸外，還包含16種其他常見蛋白質(zhì)氨基酸及5種未知成分，在已知蛋白質(zhì)氨基酸中精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的含量較高，采用面積歸一法計算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.81%、21.69%、7.86%，7.1%，其他常見蛋白質(zhì)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于4%，其中一種未知成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，達(dá)到7.5%。標(biāo)準(zhǔn)樣品及壇紫菜粗提樣品的液相色譜圖分別見圖4和圖5。

圖4 混合標(biāo)樣液相色譜圖Fig.4 Chromatogram of the mixed standard samples by PITC-HPLC

PITC-HPLC法雖然需要將樣品先進(jìn)行柱前衍生，但與其它柱前衍生法相比，其衍生過程簡便，衍生物齊全，而衍生物的高靈敏度、高穩(wěn)定性，使各種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，而與離子色譜法相比其費(fèi)用較低。為進(jìn)一步證明PITCHPLC法是一種快速、準(zhǔn)確、有效的檢測方法，還進(jìn)行了此法的線性分析、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率試驗(yàn)。

2.4.2 線性關(guān)系分析 分別取 100、50、25、10、5 μL的對照品混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其按照上述方法進(jìn)行衍生，以各種氨基酸峰面積Y為縱坐標(biāo)，氨基酸實(shí)際濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，17種氨基酸在0.078～1.25 mol/L范圍內(nèi)與峰面積比具有良好的線性關(guān)系。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品中每種氨基酸的線性回歸方程見表1。

圖5 壇紫菜樣品液相色譜圖Fig.5 Chromatogram of the sample Porphyra haitanensis by PITC-HPLC

表1 17種氨基酸的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of 17 kinds of amino acids

2.4.3 方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對照品溶液200 μL，按照上述方法衍生后連續(xù)進(jìn)樣5次，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計算RSD，考察其精密度，17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度試驗(yàn)RSD在0.20%～2.49%（n=5），均在允許范圍內(nèi)；取對照品溶液 200 μL 按照上述方法衍生后分別在 0、4、8、12、24、48、56 h進(jìn)樣，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計算RSD，考察其穩(wěn)定性，17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD在0.31%～1.31%（n=7），均在允許范圍內(nèi)；取同一批壇紫菜樣品5份，按上述方法提取、衍生、測定，以色譜峰峰面積為指標(biāo)分別計算RSD，考察方法的重復(fù)性，壇紫菜所含各種氨基酸峰面積的RSD在0.75%～2.03%，同樣均在允許范圍內(nèi)。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 吸取已知濃度的壇紫菜樣品100 μL，準(zhǔn)確加入氨基酸混標(biāo) 100 μL，按照上述方法分別衍生、進(jìn)樣，外標(biāo)法定量，如此平行5次，計算各氨基酸的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均回收率在81.50%～101.82%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.46%～2.85%，均在允許范圍內(nèi)。

2.5 制備分離

在5種未知成分衍生物中，四種由于濃度過低而未進(jìn)行制備分離，最終采用半制備高效液相色譜系統(tǒng)制備分離到其中一種濃度較高的未知衍生成分TZC，其制備分離HPLC色譜圖見圖6，TZC的出峰時間為24.4 min。收集未知成分經(jīng)無鹽流動相除鹽后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再經(jīng)真空冷凍干燥后TZC為白色絮狀固體。

2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

分離獲得的TZC是衍生劑異硫氰酸苯酯（PITC）與壇紫菜樣品某一成分通過衍生反應(yīng)生成的衍生物，其反應(yīng)方程式如下：

圖6 TZC（24.4 min）的HPLC制備分離圖Fig.6 Separation of TZC（24.4 min）by PITC-HPLC

通過紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振波譜分析，對TZC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。TZC為白色絮狀固體，IR （KBr） υ （cm-1）：3361 （NH2），3181 （COOH），1541，1303，924（Ph），1053（C=S）；TOF-MS-ESI m/z（%）：197.1008[M+H]+；1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：7.43-7.30 （m，4H），7.26-7.19 （m，1H），3.71（br，4H）；13C-NMR （100 MHz，MeOD） δ：182.3，139.4，130.4，127.1，125.8，61.4，47.9。 結(jié)合核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜數(shù)據(jù)，最終推測TZC去掉已知取代基團(tuán)PITC后的成分為乙醇胺，它的分子式為C2H7NO，相對分子質(zhì)量為61.08，其分子結(jié)構(gòu)式如圖7。

圖7 乙醇胺Fig.7 Ethanolamine

3 結(jié)語

目前用于氨基酸分離純化的方法有沉淀法、膜分離法、萃取法以及離子交換法等，其中以離子交換法應(yīng)用最為廣泛。該法根據(jù)氨基酸是兩性電解質(zhì)這一特性，以及目的氨基酸與雜質(zhì)氨基酸pK、pI值的差異，利用離子交換樹脂對各種氨基酸吸附能力的不同進(jìn)行分離純化[8-9]。作者采用Dowex 50W-X8型陽離子交換樹脂對壇紫菜游離氨基酸粗提樣品進(jìn)行分離，收集高濃度氨水洗脫液，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)分離效果較好，含有多種氨基酸組分。

近些年來，隨著氨基酸的廣泛應(yīng)用，用液相色譜法檢測氨基酸的分析水平也不斷提高，柱前衍生是先將氨基酸轉(zhuǎn)化成衍生物，再進(jìn)行色譜分離的一種衍生方法，與柱后衍生法相比，具有操作簡便、快速，靈敏度高的特點(diǎn)，并在短時間內(nèi)能分離20多種氨基酸，針對各種衍生劑的研究與開發(fā)，目前應(yīng)用廣泛的方法有異硫氰酸苯酯（PITC）法、鄰苯二甲醛-巰基乙醇（OPA）法、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）法等[10-12]。作者分別利用三種不同的檢測方法對壇紫菜游離氨基酸粗提樣品進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)其中除含有多種常見組成蛋白質(zhì)氨基酸外，還含有5種未知成分。但就方法本身來看，薄層層析法簡單快速，價格低廉，但是分辨率不高，有些氨基酸組分分不開，只能作為初步的定性分析。離子色譜檢測法雖然不需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，快速且靈敏度高，但所用儀器昂貴，檢測費(fèi)用較高。而PITC-HPLC法與其它柱前衍生法相比，其衍生過程簡便，衍生物齊全且具有高靈敏度、高穩(wěn)定性，使各種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，而與離子色譜法相比其費(fèi)用較低，因此PITC-HPLC法不失為一種快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的方法。由于本實(shí)驗(yàn)所用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）僅為17種常見蛋白質(zhì)氨基酸混合品，缺乏20種常見氨基酸中的天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸，因此其他5種未知成分還需進(jìn)一步分離純化來確定，但因其他4種質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，最終只分離獲得其中一種未知成分并做結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果為乙醇胺，并非是先前預(yù)測的氨基酸。這提醒我們能與茚三酮、PITC反應(yīng)的不只是氨基酸，也可能是醇胺或其他物質(zhì)如小肽等，在利用上述方法進(jìn)行氨基酸檢測分析時需給予考慮。

作者從壇紫菜中發(fā)現(xiàn)天然游離的乙醇胺成分并鑒定了其結(jié)構(gòu)。據(jù)報道壇紫菜的特征揮發(fā)性物質(zhì)中有一部分是醇類物質(zhì)[13-14]，乙醇胺在生物體內(nèi)參與重要的代謝調(diào)節(jié)過程。在生物體內(nèi)絲氨酸脫去一分子CO2生成乙醇胺，乙醇胺在乙醇胺激酶的作用下生成磷酸乙醇胺，磷酸乙醇胺在磷酸乙醇胺胞苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用下脫去PPi生成胞苷二磷酸乙醇胺（CDP-乙醇胺），在真核細(xì)胞中，腦磷酯是由CDP-乙醇胺和1，2-甘油二酯直接作用生成的[15-16]。乙醇胺有著重要和廣泛的應(yīng)用，它主要用作合成樹脂和橡膠的增塑劑、硫化劑、促進(jìn)劑和發(fā)泡劑，以及農(nóng)藥、醫(yī)藥和染料的中間體，也是合成洗滌劑、化妝品的乳化劑等的原料[17]。我們的研究為更好的開發(fā)利用壇紫菜提供了新的方向。

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