李曉然， 李 潔， 劉曉峰， 馮 陽， 柳陳堅

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

發(fā)酵食品是指利用微生物加工制造而成的一類具有獨特風(fēng)味與營養(yǎng)價值的食品，諸如酸奶、奶酪、泡菜、豆豉等。其中豆豉是以大豆或黃豆為主要原料，經(jīng)由原料處理、制曲及后發(fā)酵三階段釀制而成，它不僅風(fēng)味獨特，而且還富含多種生理活性物質(zhì)，因此豆豉具有開胃增食、消積化滯、驅(qū)風(fēng)散寒及預(yù)防心腦血管疾病等機能。豆豉品種繁多，根據(jù)發(fā)酵微生物的不同可以分為細(xì)菌型、曲霉型、毛霉型、根霉型和脈孢菌型等五大類[1]。由于云南省獨特的地理位置、氣候條件和民族文化傳統(tǒng)，生物資源繁多，細(xì)菌型豆豉中具有獨特和寶貴的菌種資源，由于缺乏對這些細(xì)菌全面的了解，這些寶貴的資源仍未得到很好的開發(fā)。

在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，通常采用富集純分離培養(yǎng)與鑒定方法對其中微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究，然而該方法不但操作繁瑣、費時費力，尤為重要的是在現(xiàn)有技術(shù)條件下，它僅能分離少數(shù)參與發(fā)酵的微生物，而大多數(shù)微生物得不到相應(yīng)的分離培養(yǎng)與鑒定，通過純培養(yǎng)方法僅能得到傳統(tǒng)發(fā)酵樣品中微生物群落的極少部分信息，而不能真正反映傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落的真實信息，從而給充分發(fā)掘與利用發(fā)酵食品中的微生物資源帶來一定困難。李祥研究了參與細(xì)菌型豆豉發(fā)酵的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)主要有豆豉芽孢桿菌 （Bacillus douchi）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、 乳酸桿菌 （Lactobacillus） 和微球菌（Micrococcus）[2]?；?16S rRNA 基因克隆文庫或變性梯度凝膠電泳 （DGGE）能夠規(guī)避培養(yǎng)方法的弊端，使得對于樣品中的未培養(yǎng)細(xì)菌的分析成為可能。Chen等采用了PCR-DGGE的方法分析了豆豉中微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)豆豉中都檢測到了枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、假單胞菌（Pseudomonas）、釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和粉狀畢赤酵母（Pichia farinose），同時也檢測到了潛在的病原微生物如葡萄球菌（Staphylococcus）、泛菌（Pantoea）和腸桿菌（Enterobacter）等[3]，暗示了在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中潛在致病菌存在的廣泛性，因此使用分子生物學(xué)方法對其進行檢測是極為必要的。

隨著測序技術(shù)發(fā)展，被稱為“第二代測序（nextgeneration sequencing[NGS]）”技術(shù)在過去幾年中不斷涌現(xiàn)與發(fā)展。第二代測序技術(shù)的共同特點是：高通量、低成本、可以同時對多個單獨的DNA分子進行測序分析?；赑yrosequencing[4-5]測序法一次能夠測定100萬個長度達(dá)到400 bp的核苷酸序列，其費用只相當(dāng)于使用Sanger法測定幾千個序列的費用；由于該方法不需要克隆，可解決構(gòu)建克隆文庫時所呈現(xiàn)的偏向性問題。2008年，Hamady等[6]展示一種同時可以平行分析多個樣品的焦磷酸測序法。在對不同樣品進行PCR擴增時，在引物5′末端添加由8個堿基組成的標(biāo)記（bar-code），應(yīng)用這種方法，在同一次測序反應(yīng)中可以同時分析1 544個樣品。這一方法在多種類型樣品中的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究中得到極為廣泛應(yīng)用。然而，該方法在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用還極為有限，僅有少數(shù)發(fā)酵食品使用該方法進行相應(yīng)研究[7-8]。

作者通過高通量測序和序列分析，以期獲得云南細(xì)菌型豆豉中群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為進一步利用和開發(fā)豆豉中為細(xì)菌資源提供研究基礎(chǔ)，并為食品質(zhì)量和安全提供一定信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 試驗用豆豉：購于云南省玉溪市易門縣菜市場，為當(dāng)?shù)匕傩帐止ぶ谱?。購買后置于冰盒中運送到實驗室，-80℃保存。

1.1.2 主要緩沖液 DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖。

1.2 方法與步驟

1.2.1 DNA提取 DNA提取參考Schmidt等[9]的方法并做了部分改變，步驟如下：取約0.2 g樣品置于無菌的2 mL離心管中，加入450 μL裂解緩沖液（0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖），加入 10 μL、50 mg/mL 溶菌酶（lysozyme）和 10 μL、20 mg/mL 溶壁酶（lyticase），避免劇烈振蕩，充分混合均勻后，37℃水浴30 min。加入25 μL 20%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，避免劇烈振蕩，充分混合均勻后，55℃水浴2 h以上，加入0.1 g玻璃珠（直徑 212～300 μm，美國 SIGMA），于 labnet230 V EU渦旋儀（美國labnet）以最高轉(zhuǎn)速振蕩5 min，將管子放置于研缽中，加入液氮覆蓋，待液體全部凍住后放入55℃水浴鍋中融化，重復(fù)3次。加入80 μL 5 mol/L NaCl，小心混勻后，加入60 μL 10%CTAB/NaCl，小心混勻，65℃水浴20 min。加入700 μL 苯酚：氯仿：異戊醇（體積比 25∶24∶1），顛倒混勻后于4 000 r/min離心20 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，體積比），顛倒混勻后于4 000 r/min離心20 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中，加入0.6體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜后于12 000 r/min離心15 min，倒掉液體，用500 μL預(yù)冷的70%乙醇洗沉淀，去掉液體后，將離心管打開蓋子，置于60℃烘干箱干燥，待液體全部揮發(fā)后取出，加入120 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0））緩沖液溶解DNA。提取好的DNA存放于-20℃。

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA基因擴增和焦磷酸測序 使用細(xì)菌的16S rRNA基因通用引物對提取的DNA進行擴增。擴增使用通用引物338F（5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’） 和 907R （5’-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’），并在引物338F的5’末端添加8個堿基的標(biāo)記和焦磷酸測序的AdapterA，在907R的5’末端添加AdapterB。為了減少PCR產(chǎn)物中非特異性擴增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模版后按照原來的條件再做5個循環(huán)[10]。PCR擴增采用Premix Ex TaqTM（大連TaKaRa），具體體系及程序如下：

1）PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 18 μL；Forward 引物（5 μmol/L）2 μL；Reverse 引 物 （5 μmol/L）2 μL；Premix Ex TaqTM25 μL；模板（15 ng）3 μL；總體積50 μL。

2）PCR擴增程序：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性1 min；56℃退火1 min；共30個循環(huán)。72℃延伸1 min 30 s；72 ℃延伸 7 min。

將PCR產(chǎn)物在1 g/dL的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 μg/mL EB的TAE緩沖液中，10 min后在紫外燈（216 nm）照射下呈現(xiàn)橙色條帶，目標(biāo)條帶割下后使用QIAquick Gel Extraction Kit（德國Qiangen）對PCR產(chǎn)物進行回收。使用nanodrop ND-1000分光光度計（美國Thermo）對完成純化的PCR擴增產(chǎn)物定量。使用GS-FLX（瑞士Roche）測序系統(tǒng)對DNA進行測序。

1.2.3 測序結(jié)果分類鑒定 對于焦磷酸測序的測序結(jié)果分析質(zhì)量文件，去掉測序質(zhì)量不好的序列，并對序列長度進行篩選，刪掉長度小于300 bp的序列，根據(jù)barcode將序列確定為本樣品的序列，并去除barcode和引物序列，得到有效的序列文件。使用Mallard v1.02[11]來檢測PCR產(chǎn)物序列中的嵌合體。使用mothur v1.25.1[12]的classify.seqs命令，采用Silva的核糖體小亞基（SSU）rRNA序列數(shù)據(jù)庫V102[13]的分類信息，得到序列的分類信息，分別采用80%的閾值（threshold）。

1.2.4 多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析 對所有序列使用mothur v1.25.1[12]進行比對，以0.03為cutoff值劃分可操作分類單元 （operational taxonomic unit，OTU）。計算cutoff為0.03時的ACE和Chao1值，并繪制rarefaction曲線。從細(xì)菌16S rRNA基因序列中每個OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進行Blast比對，將結(jié)果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83[14]進行比對，將比對的結(jié)果用Mega v4.0[15]中的Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列數(shù)目和多樣性指數(shù)

經(jīng)過對焦磷酸測序所得序列進行質(zhì)量和長度刪選，得到356條高質(zhì)量序列。對這些序列以0.03為cutoff進行分析，共得到62個OTU，其中，singleton42個，doubleton7個。 ACE值為 387，Chao1值為170，rarefaction曲線見圖1。可見OTU數(shù)目隨著序列數(shù)上升的趨勢還遠(yuǎn)未達(dá)到平臺期。

圖1 根據(jù)rarefaction方法估計豆豉樣品的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers，according to the rarefaction method，depending on OTUs identified with a 3%cut-off

2.2 細(xì)菌群落多樣性分析

根據(jù)Silva的SSUrRNA序列數(shù)據(jù)庫對序列進行分類，在356條序列中，有91%（324條）的序列屬于厚壁菌門（Firmicutes），9%（32 條）的序列屬于變形菌門（Proteobacteria）。在厚壁菌門中，占總序列72%（258條）的序列屬于乳桿菌科（Lactobacillaceae），10%（36 條） 的序列屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae），4%（15 條）的序列屬于肉桿菌科（Carnobacteriaceae）；在變形菌門中，所有的序列都屬于腸桿菌科 （Enterobacteriaceae），2%的序列不能確定分類信息（圖2（a））。在屬這一分類水平上，總序列的72%（256條）的序列都屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus），8%（28條） 的序列屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），而腸桿菌科的序列則大多屬于腸道菌簇（Enteric_Bacteria_cluster），3%的序列不能確定分類信息（圖 2b）。

圖2 豆豉中細(xì)菌在不同分類水平的分布Fig.2 Major families and genera in fermented soybean

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

以0.03為cutoff，對356條序列進行序列比對和距離矩陣分析，確定了62個OTU，將其中的singleton和doubleton去除后，還有13個OTU，將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，并下載相近序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。豐度最高的OTU是YM_QT，占了總序列數(shù)的64%，經(jīng)過比對，它與乳酸桿菌科的L.acidifarinae和L.zymae都有大于97%的相似度。豐度第二高的是OTU YM_DT，有11條序列，在系統(tǒng)發(fā)育樹上并未與已知分類信息的細(xì)菌呈現(xiàn)較高的相似度，但是可以確定分在芽孢桿菌屬中。有10條序列屬于OTU YM_P8，也屬于芽孢桿菌屬，與B.thermoamylovorans有98%的相似度。另有兩個OTU，YM_FM和YM_DP，均含有9條序列，雖然在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以歸入乳酸桿菌屬，但是不能與已知分類信息的乳酸桿菌聚類在一起。在變形菌門中，有兩個OTU，其中YM_W2中有8條序列，與Erwinia persicina有99%以上的相似度，而YM_JS只有3條序列，與Shigella flexneri較為相似。雖然在屬的水平只有3%的序列不能確定分類信息，但是對于豐度較高的OTU，還是有約占總序列數(shù)10%的序列不能確定到種的水平。

3 結(jié)語

近年來，食品發(fā)酵中的微生物變化受到關(guān)注并得到了研究，科學(xué)家們通過rRNA基因序列分析的方法研究了如泡菜[16]、發(fā)酵的芥末醬[17]和發(fā)酵乳品[18]等世界各地不同的發(fā)酵食品的微生物群落多樣性，作者對云南特色的豆豉中細(xì)菌群落多樣性進行了研究，使用高通量焦磷酸測序技術(shù)，得到了356條序列，較為充分地展示了豆豉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。通過多樣性指數(shù)和rarefaction曲線的結(jié)果可以看出，這一樣品細(xì)菌群落的多樣性是非常高的，因此，為了分析豆豉中的稀有群落（rare biosphere），使用高通量測序分析群落結(jié)構(gòu)是必須的。在本研究中，約10%的序列不能確定具體的分類信息，有2%的序列甚至不能確定到科，這說明豆豉雖然為富營養(yǎng)環(huán)境，含有較多的可培養(yǎng)細(xì)菌，但是仍有一部分細(xì)菌為目前不能培養(yǎng)的細(xì)菌類型。

在他人的研究中，傳統(tǒng)豆豉的生產(chǎn)有很大的地域性差異，大多豆豉為真菌（霉菌）型豆豉[1]，而在本研究中，雖然對易門豆豉采用溶壁酶共同提取了真菌的DNA，在對真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列擴增時則未得到相應(yīng)條帶，因此，易門豆豉應(yīng)該是以細(xì)菌起主要作用的細(xì)菌型豆豉。

在本研究分析的豆豉樣品中，大多數(shù)序列都集中在乳酸桿菌中，作為主要的乳酸菌種類，乳酸桿菌屬的細(xì)菌在多種發(fā)酵食品中檢測到并發(fā)揮重要作用。作為乳酸桿菌中豐度最高的OTU，YM_QT與L.acidifarinae和L.zymae都顯示了很高的相似度，這兩株菌都是從小麥酵母中分離到的[19]，也證明這兩株菌對于植物性底物的發(fā)酵具有較好的作用，是豆豉的生產(chǎn)過程中最為主要的細(xì)菌。豐度第二高的OTU為YM_P8，可認(rèn)為是B.thermoamylovorans，這是一株中度嗜熱和淀粉的細(xì)菌[20]，在豆豉制作過程中也起著重要作用。這一結(jié)果與以往的研究認(rèn)為細(xì)菌型豆豉以芽孢桿菌為主[1-2]并不相符，主要原因為：一方面，由于以前的研究大多是采用培養(yǎng)的方法，這使得芽孢桿菌更容易在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來，因此在一定程度上高估了芽孢桿菌的含量；另一方面，在基于PCR的方法的研究中，也有以芽孢桿菌為主的結(jié)果[3]，這應(yīng)該與豆豉的類型有關(guān)。在Chen的另一項研究中也發(fā)現(xiàn)主要的細(xì)菌為乳酸桿菌[21]。

圖3 豆豉中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rRNA gene sequences and their phylogenetic relatives

除了乳酸桿菌和芽孢桿菌這類在發(fā)酵中起作用的細(xì)菌，在這個豆豉樣品中，也發(fā)現(xiàn)了潛在的致病菌，YM_JS雖然只有3條序列，卻與導(dǎo)致人類腹瀉的病原菌S.flexneri顯示出高度的相似性。S.flexneri為公認(rèn)的食源致病菌，在多種類型的食品中發(fā)現(xiàn)其存在，并可能導(dǎo)致大規(guī)模腹瀉的爆發(fā)[22-25]。另一個OTU YM_W2則與E.persicina高度一致，而E.persicina則是植物的病原菌[26]，會導(dǎo)致豌豆苗萎蔫[27]，暗示了用來制作豆豉的大豆可能有過細(xì)菌性疾病。在市場隨機購買的豆豉樣品中發(fā)現(xiàn)的這兩個屬于變形菌門的OTU，一個是人類的致病菌，一個是食品原料的致病菌，無不顯示著食品安全問題的緊迫性，對于致病菌快速準(zhǔn)確的檢測是非常必要的[28]。

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