黃祝剛，于亮，左琳，滿其倩，容蓉，鞏麗麗，蔣海強，呂青濤

(山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355)

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)的干燥全草。近代研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草具有抗腫瘤、提高機體免疫功能、抗衰老、抗氧化、保肝利膽、抗化學誘變等作用［1–3］，其中主要的化合物有蒽醌類、烷烴類、萜類、有機酸類、生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、甾醇類、氨基酸以及一些微量元素等［4–6］。筆者在對白花蛇舌草乙酸乙酯部位進行抗子宮內膜癌活性研究時，通過活性篩選分離得到了對香豆酸和熊果酸兩種成分。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，對香豆酸具有抗癌和抗心血管病的作用［7–8］；熊果酸具有多方面的藥理作用，它對體外革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌均有活性，還有抗?jié)儭㈡?zhèn)咳、抗癌作用，可以抗突變、抗氧化、抗血管瘤生成和誘導癌細胞的分化［9］。為考察藥材中對香豆酸和熊果酸的含量及其與抗癌作用的關系，筆者首次建立了HPLC法同時測定白花蛇舌草中對香豆酸和熊果酸含量的方法，并對7批白花蛇舌草藥材中對香豆酸和熊果酸的含量進行了測定及對比，也為白花蛇舌草藥材活性成分含量測定提供了參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，附帶DAD檢測器、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機，美國安捷倫公司；

電子天平：AE240型，瑞士梅特勒公司；

對香豆酸、熊果酸化學對照品：批號分別為D–032–140728，X–006–140801–2，經(jīng)HPLC檢測對香豆酸和熊果酸純度均在98%以上，北京寶賽希望生物科技有限公司；

白花蛇舌草藥材：濟南市漱玉平民大藥房、七星大藥房和康之源大藥房等(產(chǎn)地及批號分別為江西111201，130301，130612；安徽130906；廣西120908，130911；湖北120618)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院李峰教授鑒定為茜草科草本植物白花蛇舌草；

甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市達森化工產(chǎn)品銷售有限公司；

實驗用水為純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse SB–C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.05%甲酸水溶液(A)–甲醇(B)，流 量 為1 mL／min；梯 度 洗 脫：0～20 min B為30%～45%，20～21 min B為45%～88%，21～45 min B為88%；柱溫：30℃；檢測波長：310 nm(對香豆酸)，210 nm(熊果酸)；進樣體積：20 μL。

1.3 對照品溶液的制備

稱取對香豆酸標準品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.035 8 mg／mL的對香豆酸溶液；稱取熊果酸標準品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成0.426 mg／mL的熊果酸溶液。

1.4 樣品溶液的制備

稱取白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)約1 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液80 mL，95℃水浴回流提取2.0 h，共提取3次，濾過，合并濾液，減壓干燥蒸干，以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制得樣品溶液。

1.5 色譜圖

在1.2色譜條件下對混合對照品溶液及樣品溶液進行測定，色譜圖見圖1。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑選擇

以對香豆酸與熊果酸的含量為指標，進行了白花蛇舌草的提取溶劑考察，比較了一系列不同濃度的乙醇提取物中二者的含量差異，最終選擇70%乙醇對二者同時提取較為適宜。

圖1 310 nm波長下混合對照品溶液色譜圖

圖2 310 nm波長下樣品溶液色譜圖

圖3 210 nm波長下混合對照品溶液色譜圖

圖4 210 nm波長下樣品溶液色譜圖

2.2 檢測波長考察

采用DAD檢測器在190～400 nm波長下進行全波長掃描，采集光譜圖，結果發(fā)現(xiàn)對香豆酸和熊果酸分別在310 nm處和210 nm處有最大吸收，故分別選擇310 nm和210 nm作為對香豆酸和熊果酸的檢測波長。當采用DAD檢測器時，可以同時采集多個波長下的色譜圖，因此可以一次完成兩個組分不同波長下的同時檢測。當采用普通紫外檢測器時，可以在工作站軟件中設置波長時間表，在兩組分的出峰時間分別采用不同波長檢測，實現(xiàn)兩個組分不同波長下的同時測定。

2.3 流動相選擇

首先采用等度洗脫的方式，結果發(fā)現(xiàn)目標成分很難與干擾峰有效分離，而采用梯度洗脫的方式，可以對對香豆酸和熊果酸達到很好的分離，并且在較短時間內同時出峰。但是采用梯度洗脫的方式時，條件控制不好會導致重現(xiàn)性差，解決辦法是延長每次進樣前的平衡時間，且每次采用相同的條件平衡色譜柱，這樣會達到很好的分離效果。實驗過程中比較了乙腈–水、乙腈–0.05%甲酸、甲醇–水、甲醇–2%冰乙酸、甲醇–0.05%甲酸5種流動相系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)采用甲醇–0.05%甲酸溶液梯度洗脫時，對香豆酸和熊果酸二者分離度均在1.5以上，各指標峰峰形良好，基線平穩(wěn)，分離度高。

2.4 線性方程

精密量取對香豆酸和熊果酸對照品儲備液0.5，1，2，4，6，8 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標線，搖勻，按2.1項下色譜條件測定各峰面積。以峰面積為縱坐標、對香豆酸和熊果酸的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得對香豆酸線性回歸方程為y=20 530x–37.56(r=0.999 8)；熊果酸線性回歸方程為y=8 321x+12.81(r=0.999 6)。結果表明，對香豆酸在0.001 79～0.028 64 mg／mL、熊果酸在0.021 3～0.340 8 mg／mL時，對香豆酸和熊果酸的質量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取同一份樣品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)測定6次，結果見表1。由表1可知，對香豆酸和熊果酸測定結果的相對標準偏差分別為0.37%和0.32%，說明該方法精密度良好。

表1 白花蛇舌草中對香豆酸和熊果酸的精密度試驗(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣分析，對香豆酸和熊果酸峰面積測定結果的相對標準偏差分別為1.4%和1.1%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一批號白花蛇舌草(0.84～0.42 mm)約1 g，精密稱定6份，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，測得藥材中對香豆酸和熊果酸的平均含量分別為0.021%和0.307%，測定結果的相對標準偏差分別為1.5%和1.8%，說明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

取已知含量同一批號的白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)1 g，精密稱量6份，分別精密加入對香豆酸和熊果酸對照品溶液，按實驗方法測定，結果見表2。由表2可知，對香豆酸和熊果酸的平均回收率分別為98.59%和98.23%，測定結果的相對標準偏差分別為0.81%和0.94%，表明方法具有較高的準確度。

表2 對香豆酸和熊果酸的加標回收試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定

取7批白花蛇舌草粉末各3份，每份1 g，精密稱定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測定對香豆酸和熊果酸的色譜峰面積，計算樣品中二者的含量，結果見表3。由表3可知，不同產(chǎn)地及批號的白花蛇舌草中二者的差異較大，其中江西產(chǎn)地的白花蛇舌草二者含量均最高，而廣西產(chǎn)地的藥材二者含量均最少。

表3 白花蛇舌草藥材中對香豆酸和熊果酸的含量測定結果(n =3)

3 結語

建立了HPLC法同時測定白花蛇舌草中對香豆酸和熊果酸兩種化合物含量的方法，該方法具有較高的準確度和良好的精密度，為白花蛇舌草藥材活性成分含量測定奠定了實驗基礎。結果表明不同產(chǎn)地及批號的白花蛇舌草中對香豆酸和熊果酸含量的差異較大，其中江西產(chǎn)白花蛇舌草中的對香豆酸及熊果酸含量均較高，所以對白花蛇舌草乙酸乙酯部位進行抗子宮內膜癌活性研究時，宜采用江西產(chǎn)的藥材。

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