宋淑敏，夏尊民，王曉楠 (黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319)

亞麻是重要的纖維及油料作物，亞麻纖維具有吸汗、透氣性良好和對人體無害等顯著特點(diǎn)，越來越受到人類重視。亞麻油含多量不飽和脂肪酸，故用來預(yù)防高血脂癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。因此亞麻具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。

我國亞麻花藥培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)70年代，并由我國首次從亞麻花藥培養(yǎng)中獲得花粉植株，但亞麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗分化率很低，且存在大量的從花藥壁等組織發(fā)育而來的二倍體植株，給單倍體鑒定帶來很大困難，嚴(yán)重制約了亞麻單倍體育種進(jìn)程。

在花藥培養(yǎng)基礎(chǔ)上開展的游離花粉小孢子培養(yǎng)技術(shù)近年來已有長足的進(jìn)步。游離花粉小孢子培養(yǎng)是把小孢子從花藥中分離出來，進(jìn)行人工培養(yǎng)?；ǚ坌℃咦优囵B(yǎng)具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。首先，游離花粉是單倍性細(xì)胞，游離花粉的培養(yǎng)可減少倍性鑒定的工作量，提高了生產(chǎn)單倍體的效率。其次，它可作為高效的細(xì)胞篩選系統(tǒng)，使農(nóng)藝性狀迅速穩(wěn)定，避免后代的分離。再次，它可作為轉(zhuǎn)基因的受體材料，通過染色體加倍，使外源基因快速純和。20世紀(jì)70年代初，NITSCH等首先報(bào)道了煙草的游離小孢子培養(yǎng)。KYO等建立了煙草的游離小孢子高效產(chǎn)生單倍體植株的方法。研究者首次從甘藍(lán)型油菜花藥中分離出小孢子并誘導(dǎo)獲得小孢子胚和再生植株［1］。研究表明，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)，直接培養(yǎng)大麥離體花粉粒，獲得了再生植株［2］。但目前關(guān)于亞麻游離花粉小孢子培養(yǎng)的研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。筆者通過研究不同基因型亞麻花粉小孢子愈傷組織誘導(dǎo)及分化的差異，篩選出花粉培養(yǎng)的理想材料;篩選出適宜亞麻花粉小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基，建立亞麻花粉小孢子離體培養(yǎng)再生體系，以期加快亞麻單倍體育種進(jìn)程，并為細(xì)胞水平的突變體篩選、轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 在黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗(yàn)田于6月中下旬采集5種不同基因型的亞麻雜交后代(F1)花粉處于單核中后期的花蕾，材料代號(hào)為 9601、9605、9712、9715、9718。將花蕾用濕紗布包裹，放入4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基 以自行研制的亞麻花培專用培養(yǎng)基HA為基本培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為HF1:HA+1.5 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L6-BA+脯氨酸300 mg/L+蔗糖30 g/L+7 g/L瓊脂粉，pH 5.5;亞麻游離花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基為HF2:HA+1.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L 瓊脂粉，pH5.5;亞麻花粉植株生根培養(yǎng)基為HF3:HA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+蔗糖30 g/L+7 g/L 瓊脂粉，pH 5.5。

1.3 方法。

1.3.1 外植體表面消毒。將亞麻花蕾放入3%的次氯酸鈉溶液中消毒15 min，再用無菌水沖洗3次，取出花藥放入盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，用針刺釋放法將花粉粒釋放到無菌水中，再通過過濾離心收集花粉，制成花粉懸浮液，花粉密度為0.5 ×102個(gè)/ml。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。將花粉懸浮液接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，放在20～25℃暗培養(yǎng)10 d，再放在20～25℃、1 000 lx條件下培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種的花粉數(shù)×100%。

1.3.3 愈傷組織的分化培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織長至5 mm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為25℃，光照時(shí)間為12 h/d，光強(qiáng)為2 000 lx。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率。愈傷組織的分化率=分化綠苗的愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)的愈傷組織數(shù)×100%。

1.3.4 生根培養(yǎng)及移栽。當(dāng)幼苗長至3～5 cm時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同“1.3.3”。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。當(dāng)根長為2 cm時(shí)，打開瓶膜煉苗3 d，用鑷子將幼苗從培養(yǎng)基中取出，再用清水洗去根部的培養(yǎng)基，然后栽入花盆中，覆蓋塑料膜保濕，5 d后揭去膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對亞麻花粉愈傷組織誘導(dǎo)的影響 以不同基因型亞麻的花粉小孢子為外植體，共接種5個(gè)雜交組合的亞麻花粉懸浮液。每個(gè)組合取2 ml花粉懸浮液(花粉密度為5.0×102個(gè)/ml)接種至HF1培養(yǎng)基上，進(jìn)行花粉愈傷組織的誘導(dǎo)，在20～25℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間8 h下培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率。10 d左右花粉愈傷組織陸續(xù)出現(xiàn)，結(jié)果表明，不同組合亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率差異顯著，其中9601、9605組合花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為30.8%、28.6%。9715的愈傷組織的誘導(dǎo)率相對較低(20.6%)(圖1)。

圖1 不同基因型亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率

2.2 不同培養(yǎng)基對花粉愈傷組織誘導(dǎo)的影響 取同一雜交組合(9601)的花粉接種至 MS、B5、N6、HF1培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基均接種4 ml花粉懸浮液(花粉密度為5.0×102個(gè)/ml)，4 種培養(yǎng)基中激素配比均為 1.5 mg/L 2.4-D，0.5 mg/L 6-BA。在20～25℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光照時(shí)間8 h下培養(yǎng)15 ～30 d。結(jié)果表明，HF1、MS、B5、N64 種培養(yǎng)基花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率分別為 29.7%、6.2%、8.6%、18.5%，以 HF1培養(yǎng)基花粉愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其次是N6培養(yǎng)基(圖2)。

2.3 不同基因型對亞麻花粉愈傷組織分化的影響 當(dāng)花粉愈傷組織長至3～5 mm，轉(zhuǎn)入亞麻花粉愈傷組織分化培養(yǎng)基HF2中，誘導(dǎo)花粉綠苗的分化，研究5種不同基因型的亞麻花粉愈傷組織在培養(yǎng)基HF2中花粉綠苗的分化情況。在18～25℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光照時(shí)間12 h下培養(yǎng)20～30 d，統(tǒng)計(jì)花粉綠苗的分化率。結(jié)果表明，不同組合之間的花粉綠苗分化頻率差異顯著，以9601組合的花粉綠苗分化頻率最高(14.5%)。其次為9718和9712，分化率分別為11.5%和8.0%(表1)。

圖2 不同培養(yǎng)基花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率

表1 不同雜交組合的愈傷組織在HF2培養(yǎng)基中花粉綠苗分化率

2.4 壯苗及生根 當(dāng)分化芽長至1～2 cm時(shí)，應(yīng)及時(shí)切取并轉(zhuǎn)至壯苗培養(yǎng)基(HA+0.5 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA)中培養(yǎng)，當(dāng)花粉綠苗長至5 cm左右時(shí)，將其轉(zhuǎn)至HF3生根培養(yǎng)基中，在20～25℃、光照強(qiáng)度1 000 lx、光照時(shí)間8 h下培養(yǎng)，亞麻花粉綠苗的生根率達(dá)95.2%以上。

3 小結(jié)與討論

(1)亞麻不同基因型影響其再生能力。不同基因型亞麻花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率和綠苗再生頻率差異較大。該研究共用了5種基因型的亞麻進(jìn)行花粉培養(yǎng)，其中9601組合的花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率、花粉綠苗再生頻率最高，9601可作為亞麻花粉培養(yǎng)的理想供試材料。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2，4-D對誘導(dǎo)花粉愈傷組織十分必要，但2，4-D的用量超過2 mg/L時(shí)，獲得愈傷組織的綠苗分化能力降低。

(3)培養(yǎng)溫度是影響亞麻花粉愈傷組織質(zhì)量的主要因素，誘導(dǎo)愈傷組織階段培養(yǎng)溫度不宜超過30℃。培養(yǎng)溫度超過30℃，易產(chǎn)生松脆、水漬狀的愈傷組織，這種愈傷組織極不宜分化，即使分化，分化出的玻璃苗較多。

(4)該研究初步建立了亞麻花粉小孢子培養(yǎng)再生體系?；ǚ坌℃咦优囵B(yǎng)體系的建立為在細(xì)胞水平上進(jìn)一步進(jìn)行亞麻單倍體育種奠定了基礎(chǔ)。今后還要對亞麻花粉小孢子培養(yǎng)體系進(jìn)行不斷完善，使亞麻花粉小孢子培養(yǎng)在細(xì)胞突變體篩選、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

［1］肖尊安.植物生物技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:106－107.

［2］顏昌敬.農(nóng)作物組織培養(yǎng)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991:255－256.