張文文， 王小敏， 肖 琦， 周忠濤， 汪 偉， 溫立斌， 李 彬， 郭容利，

張雪寒1，周俊明1， 倪艷秀1， 呂立新1， 俞正玉1， 茅愛華1， 胡屹屹1，劉永杰2，

何孔旺1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095)

TTV(Torque teno virus)又名輸血傳播病毒，最早是由日本學(xué)者M(jìn)ushawar 等［1］于1997 年發(fā)現(xiàn)的，由于該病毒是從肝炎患者體內(nèi)分離獲得的，因此懷疑其與肝炎有關(guān)，從而引起了高度關(guān)注。隨后各國對本國不同人群中TTV 感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)人群中TTV DNA 陽性率一般在10%以上［2］。目前已經(jīng)證實(shí)，除了人類可以感染TTV 以外，在靈長類動物(黑猩猩、類人猿和猴)、家畜(豬、牛、羊、犬、貓、雞)和其他動物(鼠、樹鼩和駱駝)體內(nèi)均相繼檢測到了TTV 的存在［3］。研究結(jié)果表明TTV 已經(jīng)在全世界豬群中廣泛存在，并且可能與某些疾病的發(fā)生有關(guān)［4-5］，因此已在全球引起重視。

豬TTV 屬細(xì)環(huán)病毒科(Anelloviridae)壬型細(xì)環(huán)病毒屬(Iotatorquevirus)，是一種無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA 病毒［6］。豬TTV 有2 種基因型:TTV1和TTV2［2，7］。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在中國豬群中，TTV2 的陽性率明顯高于TTV1［8-9］。ORF1基因可能編碼病毒衣殼蛋白質(zhì)(Cap)和復(fù)制相關(guān)蛋白質(zhì)(Rep)。目前國內(nèi)TTV 的檢測主要依賴于病毒核酸的檢出，主要采用PCR 的方法。因?yàn)門TV 在體外不能培養(yǎng)，無法獲得天然病毒抗原，因而使用基因工程方法表達(dá)病毒重組蛋白質(zhì)抗原是解決抗原來源的有效途徑［10-11］。因此本試驗(yàn)利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對豬TTV2ORF1基因的截短基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并制備多克隆抗體，為ORF1編碼產(chǎn)物的檢測以及研究其在病毒感染中的作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體和菌株

TTV2 病毒DNA 和表達(dá)載體pcoldI 由本實(shí)驗(yàn)室(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所)保存;大腸桿菌Trans5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

LA-Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、IPTG、氨芐青霉素均購于TaKaRa 公司;蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒購于Invitrogen 公司;DAB顯色液購于Southern Biotech 公司;Ni-NTA His-bind Resin 購于Novagen 公司;羊抗鼠IgG-HRP、羊抗豬IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 購于武漢博士德生物工程有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購于Sigma 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)動物

新西蘭大白兔(4 只)購于揚(yáng)州大學(xué)。

1.4 引物設(shè)計與目的基因的擴(kuò)增

采用Oligo V6.0 基因分析軟件，根據(jù)GenBank 上已發(fā)表的TTV2 基因序列，在ORF1基因上保守的區(qū)域設(shè)計1 對上下游引物，并在上下游引物的5'端和3'端分別加上XhoⅠ和Hind Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)，目的基因長度為1 227 bp，命名為g1。引物SFg1:5'-CCGCTCGAGGACCTCTCAGAACCATGGGTAGAAG-3'(XhoI);SRg1:5'-CCCAAGCTTTGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA-3' (Hind Ⅲ)。

以TTV2 病毒DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min，38 個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后和表達(dá)載體pcoldI 分別用XhoⅠ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，將其用T4 DNA 連接酶于4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序驗(yàn)證。

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pcold-g1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用氨芐(100 μg/ml)抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，次日按2%的比例接種于新鮮LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.4 ～0.6 時，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，于15 ℃搖床培養(yǎng)24 h。同時設(shè)置空載體誘導(dǎo)對照。離心收集菌體沉淀，經(jīng)超聲波破碎，離心，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.7 重組蛋白質(zhì)的純化及Western blot 分析

按照上述誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組菌液，菌體經(jīng)超聲波破碎后，經(jīng)鎳柱純化，使用Qubit fluorometer 及其相關(guān)試劑測定純化的蛋白質(zhì)濃度。

純化的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，將其轉(zhuǎn)印至NC 膜上，以2%的脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，置于4 ℃過夜;經(jīng)TBST 洗膜后，分別加入適當(dāng)稀釋的豬TTV2 陽性血清和 1 ∶3 000 稀釋的鼠源His 抗體，室溫孵育2 h;洗膜后再分別加入1 ∶3 000 稀釋的HRP-羊抗豬IgG 和HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h;再次洗膜后進(jìn)行DAB 顯色。

1.8 多克隆抗體的制備

1.8.1 免疫動物 首先對新西蘭大白兔耳緣動脈采血2 ml，作為陰性對照。將純化的蛋白質(zhì)按照200 μg/ml 與弗氏完全佐劑 1 ∶1 混勻，每只兔子免疫1 ml，于背部皮下多點(diǎn)注射，間隔7 d 后再免疫1 次。免疫后第21 d 和第28 d 將純化的蛋白質(zhì)按照200 μg/ml 與弗氏不完全佐劑1 ∶1 混勻，每只兔子免疫2 ml，7 d 后心臟采血，分離血清。

1.8.2 血清抗體效價的測定及Western blot 檢測采用間接ELISA 法測定抗體的效價，具體方法如下:用碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白質(zhì)稀釋為5 μg/ml，包被酶標(biāo)板，用1%BSA 于37 ℃封閉2 h;然后將兔抗血清按 1 ∶200 ～1 ∶25 600 倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，陰性對照為1 ∶50 倍稀釋的免疫前血清，空白對照為兔抗血清稀釋液，37 ℃孵育1 h;加入1 ∶3 000 稀釋的羊抗兔酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育1 h;加入TMB 顯色;最后加入H2SO4終止液。以酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度值。計算陽性血清與陰性血清之比(P/N)，當(dāng)P/N≥2.1 時為陽性，2.1＞P/N≥1.5 時為可疑，P/N＜1.5 時為陰性。

Western blot 檢測:將純化的蛋白質(zhì)經(jīng)SDSPAGE 后，轉(zhuǎn)印至NC 膜上;一抗用 1 ∶100 稀釋的兔抗血清，二抗用HRP-羊抗兔IgG，進(jìn)行Western blot 鑒定。

2 結(jié)果

2.1 豬TTV2 ORF1 截短基因的擴(kuò)增

以引物SFg1 和SRg1 擴(kuò)增TTV2 陽性DNA，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，得到1 227 bp 的目的基因(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 目的基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of target gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pcold-g1經(jīng)雙酶切后，可見1 221 bp 的目的基因(圖2)，并且測序結(jié)果與目的序列一致，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pcold-g1 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pcold-g1

2.3 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將重組表達(dá)質(zhì)粒pcold-g1和空載體pcoldI 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE 分析，在相對分子量5.2×104處有1 條很明顯的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，而空載體則無此條帶(圖3)。菌體經(jīng)超聲破碎后，沉淀中有明顯的特異條帶，而上清中沒有(圖4)，表明重組蛋白質(zhì)以包涵體形式表達(dá)為主。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pcold-g1 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed product of recombinant plasmid pcold-g1

圖4 pcold-g1 表達(dá)蛋白質(zhì)的可溶性分析Fig.4 Solubility identification of expressed protein of pcold-g1

圖5 pcold-g1 表達(dá)蛋白質(zhì)的純化和Western blot 檢測Fig.5 The purification and Western blot analysis of expressed protein of pcold-g1

Western blot 結(jié)果顯示在相應(yīng)位置出現(xiàn)1 條清晰的目的條帶(圖7)，表明獲得的多克隆抗體能

2.4 重組蛋白質(zhì)的純化及Western blot 分析

經(jīng)鎳柱純化后的重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE 分析，可見相對分子質(zhì)量為5.2×104的單一蛋白質(zhì)條帶，純度可達(dá)95%以上(圖5)。經(jīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒測定其蛋白質(zhì)濃度為264 μg/ml。

以鼠源His 抗體作為一抗，以HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示在相應(yīng)位置上出現(xiàn)一條清晰的目的條帶，而空載體對照未見相應(yīng)的目的條帶(圖5)。再以豬TTV2 陽性血清作為一抗，以HRP-羊抗豬IgG 作為二抗，進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示在相應(yīng)位置上出現(xiàn)一條清晰的目的條帶(圖6)。表明重組蛋白質(zhì)pcold-g1 可被TTV2 陽性血清識別。

2.5 多克隆抗體效價的測定及Western blot 檢測

以純化后的表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白質(zhì)作為抗原包被，以HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體作為二抗，使用免疫后的兔血清抗體做梯度稀釋，以免疫前兔血清作為陰性對照，以空載體表達(dá)產(chǎn)物包被作為空白對照，經(jīng)間接ELISA 法測定兔血清的效價，結(jié)果顯示陰性對照和空載體表達(dá)產(chǎn)物包被的一直無明顯變化，而當(dāng)多克隆抗體稀釋倍數(shù)為12 800 時，純化好的融合蛋白質(zhì)與陰性對照OD值之比(P/N)仍≥2.1。因此，融合蛋白質(zhì)對兔抗多克隆抗體具有良好的免疫原性，抗體效價為1 ∶12 800。夠特異性識別相應(yīng)的目的蛋白質(zhì)，具有較高的特異性。

圖6 一抗為豬TTV2 陽性血清的Western blot 檢測Fig.6 Western blot analysis of the recombinant protein using the porcine TTV2 positive serum as the primary antibody

圖7 pcold-g1 重組蛋白質(zhì)多克隆抗體的Western blot 檢測Fig.7 Western blot analysis of polyclonal antibody of recombinant protein of pcold-g1

3 討論

TTV 主要由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分組成，編碼區(qū)ORF1可能編碼病毒的衣殼蛋白質(zhì)，ORF2 可能編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)［2］。目前，TTV 檢測方法主要是PCR，ELISA 方法尚未建立，是研究者急需解決的問題。國內(nèi)尚未見豬TTV2ORF1基因克隆表達(dá)、功能研究的相關(guān)報道。因ORF1N 端為精氨酸富集區(qū)，含有大量的稀有密碼子，不易表達(dá)。因此本試驗(yàn)利用PCR 技術(shù)對豬TTV2 的ORF1部分基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用pcoldI 作為表達(dá)載體，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了TTV2 的ORF1截短基因。

本試驗(yàn)選用的表達(dá)載體pcold 是一種低溫表達(dá)載體，使目的基因能在低溫(15 ℃)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，可以提高表達(dá)產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性［12］。但在本試驗(yàn)中所表達(dá)的蛋白質(zhì)仍是以包涵體的形式存在的，即使再降低溫度也仍存在于包涵體中，這可能與所表達(dá)的目的蛋白質(zhì)基因本身有關(guān)。此外，通過該載體上的His 標(biāo)簽，可以用鎳柱對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

本試驗(yàn)擴(kuò)增的ORF1基因片段，在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，蛋白質(zhì)以包涵體的形式存在，通過鎳柱對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到了高純度的重組蛋白質(zhì)。我們將豬TTV2 的陽性血清作為Western blot 的一抗，以HRP-羊抗豬IgG 作為二抗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示豬TTV2 陽性血清在相應(yīng)位置出現(xiàn)了目的條帶。同時還用鼠源His 抗體作為一抗和HRP-羊抗鼠IgG 作為二抗進(jìn)行Western blot 檢測，也在相應(yīng)位置出現(xiàn)了特異性反應(yīng)條帶，這些試驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白質(zhì)得到了正確的表達(dá)，能夠與TTV2 陽性血清反應(yīng)，具有很好的免疫原性，為下一步建立豬TTV2 的間接ELISA 檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

多克隆抗體在免疫學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，在臨床應(yīng)用中，既能用于疾病的診斷，又能用于疾病的治療，它在特異性、穩(wěn)定性方面雖不如單克隆抗體，但是成本低廉、制備簡單，具備多個抗原決定簇，能夠更好地與抗原結(jié)合。本試驗(yàn)利用純化的重組蛋白質(zhì)免疫家兔制備的多克隆抗體經(jīng)間接ELISA 檢測效價為1 ∶12 800，特異性好，為ORF1基因的深入研究、檢測方法的建立以及相關(guān)基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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