戚維聰， 程計(jì)華， 黃邦全， 李 坦， 林 峰

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇 南京210014;2.荷蘭瓦赫寧根大學(xué)植物育種系，荷蘭 瓦赫寧根6708PB;3.中國(guó)科學(xué)院武漢植物園，湖北 武漢430074;4.湖北大學(xué)生命科學(xué)院，湖北 武漢430062)

海甘藍(lán)(Crambe abyssinica)是異源六倍體(2n=6x=90)，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，屬于十字花科(Brassicaceae)兩節(jié)薺屬(Crambegenus)［1-2］。生產(chǎn)芥酸是海甘藍(lán)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要體現(xiàn)，海甘藍(lán)的芥酸含量達(dá)到60%。芥酸(順-13-二十二碳一烯酸)是一種長(zhǎng)碳鏈不飽和脂肪酸，在化工中應(yīng)用廣泛，其衍生物芥酸酰胺是塑料生產(chǎn)的必須添加劑，主要作用是潤(rùn)滑，防止粘連。除此之外芥酸還可以被用在制藥、生產(chǎn)船舶表面涂料和尼龍等多個(gè)方面［1，3］。全球?qū)嫠崮晷枨罅看笄以鲩L(zhǎng)迅速，從1990 年到2010 年，總消費(fèi)量從1.8 ×107t 增長(zhǎng)至3.5 ×107t，大約翻了一番。近年來(lái)由于大面積推廣種植雙低油菜，高芥酸資源出現(xiàn)短缺。為了滿(mǎn)足工業(yè)上對(duì)芥酸這一重要化工原料的需求，美國(guó)、荷蘭等國(guó)相繼培育、釋放、種植了一系列高芥酸含量的海甘藍(lán)新品種。海甘藍(lán)中度耐鹽，適合在鹽堿等邊際性土地上生長(zhǎng)。中國(guó)擁有近2.2 ×106hm2海洋灘涂，利用這些邊際性土地種植高芥酸海甘藍(lán)將產(chǎn)生顯著經(jīng)濟(jì)效益［4-5］。

海甘藍(lán)作為一個(gè)“新”的經(jīng)濟(jì)作物，其遺傳研究較為薄弱。目前，NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)只搜集了37 條海甘藍(lán)EST 序列，基于海甘藍(lán)遺傳信息開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記尚未見(jiàn)報(bào)道。二代測(cè)序技術(shù)的推廣和應(yīng)用為快速有效地發(fā)展“新”經(jīng)濟(jì)作物的分子標(biāo)記提供了契機(jī)［6-7］。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq 數(shù)據(jù)的從頭拼接(De novo)和組裝，海量測(cè)序短片段被連接成一類(lèi)較長(zhǎng)的重疊群(Contigs)，這些重疊群包含了特定發(fā)育時(shí)期的部分轉(zhuǎn)錄本信息［8］。轉(zhuǎn)錄本含有大量的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)，由于簡(jiǎn)單重復(fù)序列變異度較高，這些位點(diǎn)已成為開(kāi)發(fā)功能分子標(biāo)記的理想靶位點(diǎn)［8-9］。利用RNA-Seq 組裝的重疊群序列開(kāi)發(fā)EST-SSR 分子標(biāo)記的技術(shù)已在蓖麻、草坪草、芝麻，紅薯和咖啡等植物中廣泛應(yīng)用［10-12］。但是由于海甘藍(lán)研究中尚未獲得足夠數(shù)量的EST 和RNA-Seq 數(shù)據(jù)信息，開(kāi)發(fā)EST-SSR 分子標(biāo)記仍是空白。

海甘藍(lán)種子發(fā)育階段是合成芥酸的主要時(shí)期，關(guān)鍵基因在這段時(shí)間內(nèi)相繼表達(dá)。基于此，我們將對(duì)發(fā)育時(shí)期種子進(jìn)行高通量深度測(cè)序，利用從頭拼接軟件獲得重疊群，對(duì)這些重疊群序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)掃描，并對(duì)海甘藍(lán)基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以期為揭示海甘藍(lán)遺傳背景的多樣性以及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建提供第一代SSR 分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試材料及全基因組測(cè)序

海甘藍(lán)品種為C.abyssinicacv.Galatic。去殼種子置于鋪有3 層潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，發(fā)芽后移入溫室土壤栽培，待植物開(kāi)花后掛牌標(biāo)記。取開(kāi)花后20 d 的種子提取mRNA(10 粒為一組)，試劑盒為iScriptTMcDNA Synthesis Kit (Bio-rad，USA)。DNA提取材料種植條件如前所述，取0.5 g 新鮮葉片提取基因組DNA。

1.2 組裝拼接

采用Illumina HiSeq 2000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)一步利用SolexaQA［13］軟件包對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量(Q20，Phred-Score≥20 即1%的錯(cuò)誤率)和測(cè)序長(zhǎng)度(L40，長(zhǎng)度≥40 bp)過(guò)濾。隨后，利用Trinity轉(zhuǎn)錄組組裝軟件［14］按默認(rèn)參數(shù)對(duì)清理后的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組從頭de novo組裝。

1.3 SSR 全基因組挖掘及引物設(shè)計(jì)

對(duì)Trinity 程序組裝獲得的轉(zhuǎn)錄組重疊群序列，用MISA 程序(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)掃描轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)，滿(mǎn)足單堿基重復(fù)超過(guò)10 次或雙堿基重復(fù)超過(guò)8 次或三堿基重復(fù)超過(guò)5 次或四堿基重復(fù)超過(guò)4 次或五堿基重復(fù)超過(guò)2 次或六堿基重復(fù)超過(guò)3 次被定義為SSR 位點(diǎn)。通過(guò)Perl 語(yǔ)言抽取SSR 位點(diǎn)側(cè)翼序列后利用Primer 3(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi)進(jìn)行PCR 特異引物設(shè)計(jì)，退火溫度為(58 ±3)℃。

1.4 海甘藍(lán)SSR 位點(diǎn)在白菜基因組的定位及注釋

為了進(jìn)一步揭示海甘藍(lán)EST-SSRs 相關(guān)的基因組信息及變異效應(yīng)，利用所開(kāi)發(fā)的SSRs 分子標(biāo)記保守側(cè)翼序列，結(jié)合白菜基因組序列信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AENI00000000)，通過(guò)Blast［14］同源比對(duì)，去除冗余以及進(jìn)行全基因組物理定位。SSR 位點(diǎn)多態(tài)性比較則主要通過(guò)電子ePCR 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/)完成，利用本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)白菜基因組中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

1.5 PCR 擴(kuò)增和電泳

PCR 反應(yīng)總體系為25.0 μl，包括10 ×Buffer(含Mg2+)2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Taq酶0.1 μl，引物2.0 μl，模板DNA 2.0 μl，ddH2O 15.9 μl，上覆20.0 μl礦物油。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，共進(jìn)行38 個(gè)循環(huán)。用2%瓊脂糖膠加壓100 V 進(jìn)行電泳，紫外透射儀上觀(guān)察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 組裝拼接

利用Illumina Paired-End 100 bp×2 雙端測(cè)序，經(jīng)Q20 質(zhì)量過(guò)濾和L40 長(zhǎng)度清理，獲得了86 224 256 條平均長(zhǎng)度約93 bp，共計(jì)7 999 663 632個(gè)堿基的重疊群。數(shù)據(jù)進(jìn)一步利用Trinity 組裝程序進(jìn)行從頭de novo組裝，共獲得長(zhǎng)度等于200 個(gè)堿基的重疊群序列234 622條，重疊群平均長(zhǎng)度為956 bp，其中N50 為1 428 bp，最長(zhǎng)的重疊群為16 475 bp。由于組裝后的重疊群存在選擇性剪切產(chǎn)生的冗余，利用Blastn (1e-50)去除高相似度的序列后得到186 778條重疊群，這些重疊群序列用于后續(xù)的SSR 挖掘。

2.2 EST-SSR 位點(diǎn)掃描

MISA 軟件掃描重疊群后共發(fā)現(xiàn)在38 601條序列中含有47 073個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中有6 816條重疊群含有1 個(gè)以上的SSR 位點(diǎn)，平均每4 500 bp 含有1 個(gè)SSR位點(diǎn)。除了單堿基重復(fù)10 次的SSR 位點(diǎn)外(45%)，三堿基重復(fù)SSR 位點(diǎn)占了總數(shù)的29%，雙堿基重復(fù)占10%，五堿基重復(fù)占7%，六堿基重復(fù)占5%，四堿基重復(fù)占2%。三堿基重復(fù)中AAG/CTT 基序存在于4 993條序列中，豐度最高(表1、表2、圖1)。

表1 海甘藍(lán)EST-SSR 搜索結(jié)果Table 1 Summary of EST-SSR searching resulting results

表2 海甘藍(lán)EST-SSR 位點(diǎn)長(zhǎng)度信息Table 2 Length distribution of EST-SSR based on the number of repeat units

2.3 EST-SSR 引物設(shè)計(jì)及過(guò)濾

利用SSR 位點(diǎn)側(cè)翼保守序列，共設(shè)計(jì)了16 355對(duì)SSR 引物。PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增范圍為150 ～400 bp。利用Blastn 對(duì)電子PCR 產(chǎn)物進(jìn)行了冗余性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)只有6 639條引物可以專(zhuān)化擴(kuò)增出唯一特異性條帶。利用已測(cè)序白菜基因組信息對(duì)6 639對(duì)引物進(jìn)行篩選，在5'端允許3 個(gè)堿基錯(cuò)配，3'端不允許錯(cuò)配，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度大于200 bp，小于500 bp 的條件下，獲得了1 206條物種間可通用的EST-SSR 引物。根據(jù)白菜基因組每10 kb DNA 區(qū)間內(nèi)只允許存在一個(gè)分子標(biāo)記的條件下，共獲得了688 個(gè)分子標(biāo)記。圖2 列出了這些分子標(biāo)記在白菜基因組的物理位置。除個(gè)別位置外，ESTSSR 分子標(biāo)記的位置在染色體上基本呈均勻分布。

圖1 三核苷酸不同基序排列分布Fig.1 Frequency distribution of trinucleotide EST-derived SSRs based on motif sequences

2.4 EST-SSR 分子標(biāo)記驗(yàn)證

基于白菜基因組信息，在每條染色體臂兩端各挑選了一個(gè)SSR 位點(diǎn)，共計(jì)20 對(duì)EST-SSR 引物在海甘藍(lán)中進(jìn)行引物驗(yàn)證(表2)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的20 對(duì)SSR 引物中，擴(kuò)增成功率達(dá)100%。20 對(duì)PCR 產(chǎn)物片段大小均與預(yù)測(cè)結(jié)果完全吻合(圖3)。

3 討論

通過(guò)對(duì)已公開(kāi)EST 序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)掃描開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的方法已被廣泛地運(yùn)用。海甘藍(lán)作為一個(gè)“新”作物，其EST 信息在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中幾乎為空白。我們通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)，首次獲得了大量海甘藍(lán)EST 序列。其中約有3%左右的序列含有SRR位點(diǎn)，這些位點(diǎn)側(cè)翼序列為設(shè)計(jì)引物提供了模板。雖然通過(guò)以上的方法可以快速高效設(shè)計(jì)EST-SSR引物，但是在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，二代測(cè)序拼接結(jié)果中含有大量冗余(Redundancy)序列，基于這些冗余序列開(kāi)發(fā)的一系列EST-SSR 引物只能被認(rèn)定為一個(gè)位點(diǎn)的分子標(biāo)記。導(dǎo)致大量冗余序列的主要原因是RNA 選擇性剪切和測(cè)序過(guò)程中的污染。因此，在設(shè)計(jì)海甘藍(lán)EST-SSR 引物前，我們首先對(duì)Trinity 拼接結(jié)果進(jìn)行了過(guò)濾，通過(guò)序列之間相互對(duì)比，去除了30%高相似度的重疊群。其次對(duì)余下的序列進(jìn)行了功能注釋?zhuān)瑒h除明顯來(lái)自人類(lèi)和細(xì)菌的污染序列。最后，利用海甘藍(lán)近緣物種白菜基因組序列，淘汰了物理位置在10 kb 之內(nèi)的分子標(biāo)記。通過(guò)以上3 種過(guò)濾，本研究最大程度地獲得了688 個(gè)全基因組較為分散的SSR 分子標(biāo)記。

由于EST 主要編碼功能基因，受選擇壓力大，序列保守性高，導(dǎo)致EST-SSR 所揭示的多態(tài)性相對(duì)基因組SSR 低［13，15-17］。研究表明，在EST 的3'區(qū)存在較高的三核苷酸變異率。如控制人類(lèi)亨丁頓舞蹈癥的HTT基因是在第四對(duì)染色體，HTT基因重復(fù)排序數(shù)目CAG 太多時(shí)會(huì)造成亨丁頓舞蹈癥，重復(fù)數(shù)28 次以下沒(méi)有亨丁頓舞蹈癥表現(xiàn)，而40 以上有亨丁頓舞蹈癥，基于CAG 重復(fù)序列開(kāi)發(fā)的SSR 標(biāo)記在人類(lèi)不同個(gè)體間具有較高的多態(tài)性［9］。玉米Prolamin 蛋白結(jié)合因子(PBF)在3'區(qū)也存在一個(gè)高變異率的ACC 三核苷酸序列，基于該重復(fù)序列開(kāi)發(fā)的umc1065 EST-SRR 分子標(biāo)記在玉米不同自交系間揭示極高的多態(tài)性［18］。盡管根據(jù)EST 設(shè)計(jì)的SSR 較根據(jù)基因組設(shè)計(jì)的多態(tài)性偏低，但由于與功能基因緊密相連，可被開(kāi)發(fā)成功能性分子標(biāo)記，顯著提高分子標(biāo)記對(duì)目的功能基因的選擇效率。

EST-SSR 引物較根據(jù)基因組信息設(shè)計(jì)的SSR 引物擴(kuò)增成功效率偏低，原因主要一方面引物結(jié)合位點(diǎn)落在外顯子與外顯子的連接區(qū)，該區(qū)段在基因組上被內(nèi)含子隔開(kāi)，導(dǎo)致引物無(wú)特定結(jié)合區(qū)域;另一方面，PCR 擴(kuò)增區(qū)域若含有較長(zhǎng)的內(nèi)含子，引物在基因組DNA 為模板時(shí)由于區(qū)段太長(zhǎng)，無(wú)法獲得有效的擴(kuò)增。由于缺乏海甘藍(lán)基因組信息，無(wú)法僅通過(guò)生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)內(nèi)含子的位置和大小。為了最大程度解決EST-SSR 引物擴(kuò)增效率偏低的問(wèn)題，我們利用海甘藍(lán)的近緣種白菜的基因組測(cè)序信息來(lái)過(guò)濾外顯子連接區(qū)和大內(nèi)含子區(qū)，最終獲得了近688 個(gè)高質(zhì)量的引物信息。這些白菜和海甘藍(lán)通用分子標(biāo)記(Transferable EST-SSR markers)可以被用于這兩個(gè)物種間的比較基因組研究，利用白菜的遺傳信息加速海甘藍(lán)關(guān)鍵基因的鑒定和克隆。

注:本研究獲得的EST-SSR 引物及對(duì)應(yīng)的具體信息可向作者索取。

［1］ KANEKO Y，BANG S，MATSUZAWA Y.Wild crop relatives:genomic and breeding resources［M］.Berlin:Springer，2011:247-258.

［2］ WARWICK S，GUGEL R.Genetic variation in theCrambe abyssinica-C.hispanica-C.glabratacomplex［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50(3):291-305.

圖2 海甘藍(lán)EST-SSR 分子標(biāo)記在白菜基因組物理分布Fig.2 The physical localization of EST-SSR on Brassica napa genome

圖3 20 對(duì)SSR 引物基因組擴(kuò)增帶型Fig.3 PCR banding patterns of Crambe abyssinice cv.Galatic by 20 SSR primer pairs

［3］ ABADA Y S K，NGUYEN H P，SCHREIBER R，et al.Assessment of motor function，sensory motor gating and recognition memory in a novel BACHD transgenic rat model for Huntington disease［J］.PLoS ONE，2013，8(7):e68584.

［4］ METTERNICHT G，ZINCK J.Remote sensing of soil salinity:potentials and constraints ［J］.Remote Sensing of Environment，2003，85(1):1-20.

［5］ RHOADES J，MANTEGHI N，SHOUSE P，et al.Soil electrical conductivity and soil salinity:new formulations and calibrations［J］.Soil Science Society of America Journal，1989，53(2):433-439.

［6］ VARSHNEY R K，NAYAK S N，MAY G D，et al.Next-generation sequencing technologies and their implications for crop genetics and breeding［J］.Trends in Biotechnology，2009，27(9):522-530.

［7］ DAVEY J W，HOHENLOHE P A，ETTER P D，et al.Genomewide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing［J］.Nature Reviews Genetics，2011，12(7):499-510.

［8］ RAHMAN M，SUN Z，MCVETTY P B.High throughput genomespecific and gene-specific molecular markers for erucic acid genes inBrassica napus(L.)for marker-assisted selection in plant breeding［J］.Theoretical and Applied Genetics，2008，117(6):895-904.

［9］ RIESS O，NOERREMOELLE A，SOERENSEN S A，et al.Improved PCR conditions for the stretch of (CAG)n repeats causing Huntington's disease［J］.Human Molecular Genetics，1993，2(6):637.

［10］ AGGARWAL R K，HENDRE P S，VARSHNEY R K，et al.Identification，characterization and utilization of EST-derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，114(2):359-372.

［11］ FEINGOLD S，LLOYD J，NORERO N，et al.Mapping and characterization of new EST-derived microsatellites for potato (Solanum tuberosumL.)［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，111(3):456-466.

［12］ ZHANG T，GE M，YE X，et al.Construction of a linkage map for quantitative trait loci associated with economically important traits in creeping bentgrass (Agrostis stoloniferaL.)［J］.Euphytica，2012，188(3):347-360.

［13］ GORBACH D M，HU Z L，DU Z Q，et al.Mining ESTs to determine the usefulness of SNPs across shrimp species［J］.Animal Biotechnology，2010，21(2):100-103.

［14］ ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCH?FFER A A，et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs［J］.Nucleic Acids Research，1997，25(17):3389-3402.

［15］ MUCHERO W，DIOP N N，BHAT P R，et al.A consensus genetic map of cowpea［Vigna unguiculata(L.)Walp.］and synteny based on EST-derived SNPs［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(43):18159-18164.

［16］ SEHGAL D，RAJARAM V，ARMSTEAD I P，et al.Integration of gene-based markers in a pearl millet genetic map for identification of candidate genes underlying drought tolerance quantitative trait loci［J］.BMC Plant Biology，2012，12(1):9.

［17］ XUE S，ZHANG Z，LIN F，et al.A high-density intervarietal map of the wheat genome enriched with markers derived from expressed sequence tags ［J］.Theoretical and Applied Genetics，2008，117(2):181-189.

［18］ VICENTE-CARBAJOSA J，MOOSE S P，PARSONS R L，et al.A maize zinc-finger protein binds the prolamin box in zein gene promoters and interacts with the basic leucine zipper transcriptional activator Opaque2［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94(14):7685-7690.