何林池， 王 康， 魏小云， 榮 平， 王亞峰

(1.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南通226541;2.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通226019)

鹽害是沿海灘涂地區(qū)作物生產(chǎn)中常見的非生物脅迫。土壤鹽漬化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，1.0 ×109hm2的鹽漬土約占全球陸地面積的7.6%［1］，廣泛分布在100 多個國家和地區(qū)。而且，由于土壤的次生鹽漬化，全球鹽漬化面積還在迅速增加，每年約有1.0 ×107hm2土地因土壤的次生鹽漬化而廢棄。中國是世界鹽堿地面積較大的國家之一，其中海涂土壤近2.41 ×106hm2，占海岸帶土壤總面積的17.35%［2］。因此，加速沿海灘涂的開發(fā)利用并解決土地鹽漬化的生態(tài)問題迫在眉睫，而開發(fā)耐鹽性強的農(nóng)作物品種是一條有效的措施。棉花是耐鹽性較強的農(nóng)作物，通常能夠在含鹽量0.3%以下的土壤里正常生長，并產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益［3］;然而，沿海灘涂和鹽漬化地區(qū)的土壤含鹽量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過0.3%，因此研究棉花的耐鹽機制，篩選并培育出耐鹽性更強的棉花品種，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大。

自由基是正常的機體代謝中間產(chǎn)物［4-6］。低濃度自由基是機體正常生理功能所必需的，但自由基含有未配對電子，具有高度反應(yīng)活性，可引發(fā)鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)，過量的自由基會損傷機體。在衰老或逆境條件下，棉花體內(nèi)活性氧自由基如O-2、H2O2水平過高，會影響植株的正常生長和產(chǎn)量。在棉花體內(nèi)存在著抗氧化酶體系，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等，可以清除體內(nèi)多余的活性氧自由基，從而保證體內(nèi)自由基處于較低水平，使自身免受其傷害?？寡趸富钚缘奶岣呤腔钚匝踝杂苫黾雍兔{迫條件下減少氧傷害和保護(hù)系統(tǒng)建立的標(biāo)志。這些不同的抗氧化酶協(xié)同作用共同抵抗鹽分脅迫所誘導(dǎo)的氧化傷害［7］。然而，一旦逆境脅迫超過一定范圍后，自由基大量產(chǎn)生，抗氧化酶系統(tǒng)無法有效地將多余的自由基清除，破壞了體內(nèi)平衡，會嚴(yán)重影響棉花的生長。因此抗氧化酶體系與棉花的耐鹽性息息相關(guān)。

中棉所35 與中棉所12 親緣關(guān)系較近而耐鹽性差異顯著［8］，其耐鹽差異性機理值得探討。本研究旨在揭示鹽脅迫下棉花抗氧化酶體系的生理活性變化，深入了解棉花耐鹽性生理調(diào)節(jié)機理;同時，以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 為參考，對中棉所35 和中棉所12 單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行初步鑒定，為棉花耐鹽分子育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐鹽材料中棉所35、鹽敏感材料中棉所12 和陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)資源中期庫提供。

取中棉所35 和中棉所12 兩個棉花品種種子各30 粒，在水中浸泡12 ～24 h，然后采用雙層濾紙發(fā)芽法促使種子發(fā)芽。具體操作如下:將濾紙用蒸餾水浸濕鋪于培養(yǎng)皿中，然后取泡好的棉花種子均勻擺放在濾紙上，再用一張浸濕的濾紙蓋在種子上，每天用洗瓶將上層濾紙適量噴濕，同時觀察記錄種子發(fā)芽情況。待棉花種子發(fā)芽以后，分別種植到裝好營養(yǎng)土的小紙杯當(dāng)中，放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天澆適量的水。10 d 后，將棉花幼苗移栽到桶中，每個品種選取15 顆生長狀況良好且相對一致的棉花幼苗，分成3 組作為3 次重復(fù)，每組5 顆。待棉花長出4 片葉子以后，每個品種每組取4 株 分 別 用100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L NaCl 溶液澆灌，1 d 澆2 次，每次澆100 ml;剩余1 株作為空白對照，澆等量清水。鹽脅迫處理后3 d，在同一時刻，每組取相同葉位的葉片，裝入50 ml 離心管，用以測定3 種抗氧化酶的活性。另取TM-1 種子3 粒，同上催芽種植，以備提取基因組DNA。

1.2 抗氧化酶活性的測定

稱取棉花葉片0.5 ～1.0 g，加入5 ～10 ml 提取液［50 mmol/L PBS(pH 7.8，含0.1 mmol/L EDTA、0.3% Triton X-100、0.4%聚乙烯吡咯烷酮)］，研磨后用紗布過濾，4 ℃下15 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶液。將粗酶液稀釋約10 倍，用于酶活性的測定。CAT、POD和SOD活性測定采用紫外分光光度法［9］。

1.3 SNP/InDel 分析

1.3.1 DNA 提取 取中棉所12、中棉所35 及陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 的新鮮幼嫩葉片進(jìn)行DNA 的分離純化。棉花葉片基因組總DNA 的分離與純化參考Paterson 等［10］的方法，并略作改進(jìn)。

1.3.2 PCR 擴增及電泳 選用棉花耐鹽相關(guān)ESTSSR 引物NTU060 對以上3 份材料進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系:1 μl 模板DNA(約50 ng/μl)，1 μl dNTPs(2 mmol/L)，1 μl 10 × Buffer(含25 mmol/L Mg+)，1 μl 引 物(正 向 引 物 和 反 向 引 物，2 μmol/L)，1 UTaq酶，最后加ddH2O 至總體積為10 μl。PCR 擴增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán);72 ℃延伸7 min，最后4 ℃恒溫保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用12%的聚丙烯酰胺凝膠，150 V 恒壓電泳2 h，銀染方法參照張軍等［11］。

1.3.3 DNA 測序及序列分析 從12%的聚丙烯酰胺非變性膠中回收條帶，放入干凈的離心管中，加入100 μl ddH2O，室溫放置10 ～30 min，100 ℃煮沸15 min，自然冷卻。從中取10 μl 上清液為模板，用原來的引物組合和反應(yīng)條件重新做PCR。取5 μl 擴增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測，確信擴增成功后將剩余產(chǎn)物委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行克隆測序。用DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下棉花SOD 活性變化

不同鹽濃度處理下棉花SOD活性與鹽濃度的關(guān)系見圖1，耐鹽品種中棉所35 在不同鹽脅迫下SOD活性的變化較小，隨著鹽濃度的增大略有上升趨勢。鹽敏感品種中棉所12 的SOD活性隨著鹽濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在300 mmol/L的鹽脅迫下活性達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度達(dá)到400 mmol/L時，鹽敏感品種中棉所12 的SOD活性開始低于耐鹽品種中棉所35。

2.2 鹽脅迫下棉花CAT 活性變化

耐鹽品種中棉所35 在100 mmol/L的鹽濃度處理下酶活性最高，鹽敏感品種中棉所12 在200 mmol/L的鹽濃度處理下酶活性最高;兩個品種的CAT活性變化趨勢都是先增加后下降，而中棉所35 在鹽處理下CAT整體活性水平高于中棉所12(圖2)。

2.3 鹽脅迫下棉花POD 活性變化

由圖3 可以看出兩個棉花品種的POD活性隨著鹽濃度的增加都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。其中耐鹽品種中棉所35 在鹽濃度為100 mmol/L 時POD活性達(dá)到最大值，而鹽敏感品種中棉所12 在鹽濃度為200 mmol/L時POD活性達(dá)到最大值?？傮w而言，相對于中棉所12，中棉所35 的POD活性處于較高的水平。

圖1 鹽脅迫對不同棉花品種SOD 活性的影響Fig.1 Effect of salt stress on SOD activity in different cotton varieties

圖2 鹽脅迫對不同棉花品種CAT 活性的影響Fig.2 Effect of salt stress on CAT activity in different cotton varieties

圖3 鹽脅迫對不同棉花品種POD 活性的影響Fig.3 Effect of salt stress on POD activity in different cotton varieties

2.4 DNA 測序及序列分析

選擇針對棉花耐鹽相關(guān)EST 序列開發(fā)的SSR引物NTU060［SSR 重復(fù)類型為(TAA)3，其對應(yīng)的擬南芥基因編號為AT5G57110.2］，對中棉所35、中棉所12 進(jìn)行擴增，同時對陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 進(jìn)行擴增以作為對照，再進(jìn)行序列比對以初步了解其單核苷酸水平的差異。序列比較結(jié)果顯示，NTU060擴增的產(chǎn)物在這3 份材料中存在著單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，其中包括轉(zhuǎn)換、堿基缺失或插入(Insertion/deletion，InDel)。耐鹽品種中棉所35 和鹽敏感品種中棉所12 的擴增產(chǎn)物在第124 堿基處存在有1 個InDel，在第169 堿基處存在1 個A/G 轉(zhuǎn)換，在第175 堿基處存在1 個C/T轉(zhuǎn)換(圖4)。

圖4 SSR 引物NTU060 在中棉所35、中棉所12 及TM-1 中的擴增產(chǎn)物序列比對Fig.4 Multi-sequence alignment of SSR products of CCRI 35，CCRI 12 and TM-1 with primer NTU060

3 討論

逆境條件下，自由基大量產(chǎn)生，植物體內(nèi)原有的平衡被打破，從而對植物體產(chǎn)生傷害。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)作為植物內(nèi)源的活性氧清除劑，是清除H2O2等活性氧自由基的重要保護(hù)酶，在一定程度上保護(hù)著細(xì)胞膜系統(tǒng)［12］。在逆境中維持較高的抗氧化酶活性，才能有效地清除活性氧使之保持較低水平，從而減少其對膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，因而保護(hù)酶體系在抗逆境研究中頗受重視。王秀玲等［13］在鹽脅迫對甜高粱生理生化特性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，NaCl 脅迫不同程度地提高了不同甜高粱材料的SOD、CAT及POD活性，不同濃度的NaCl 脅迫后不同甜高粱材料SOD、CAT及POD活性的變化趨勢有所不同，這可能是它們耐鹽差異的生理原因之一。楊淑萍等［14］的研究結(jié)果表明，海島棉耐鹽品種在低濃度NaCl 處理下可通過提高根、葉內(nèi)的POD、CAT活性來清除多余的活性氧，在高濃度NaCl 處理下，CAT活性受到抑制;而鹽敏感品種在低濃度NaCl 脅迫下抗氧化酶活性便受到抑制，生物膜受影響，引起膜脂過氧化。本試驗中，在不同濃度的鹽脅迫下棉花耐鹽品種和鹽敏感品種的SOD、CAT及POD酶活性變化表現(xiàn)不同。

SOD是一種典型的誘導(dǎo)酶，它的活性變化在一定程度上反映了植株受脅迫的程度。SOD是抗氧化系統(tǒng)中一種極為重要的酶，在酶保護(hù)系統(tǒng)中處于核心地位［15］。SOD的主要功能是清除O-2，生成無毒的O2和毒性較低的H2O2(2 O-2+2H+→O2+H2O2)。在本試驗中，中棉所35 的SOD活性隨著鹽濃度的上升基本保持不變，其活性的相對穩(wěn)定說明該品種的SOD有較強的耐鹽性;中棉所12SOD活性的變化趨勢表明一在定鹽濃度范圍內(nèi)，機體為了適應(yīng)逆境環(huán)境產(chǎn)生過多的自由基，引起SOD活性的上升，清除過多的自由基從而保護(hù)機體的膜系統(tǒng)，但隨著鹽濃度的繼續(xù)增加，棉花葉片細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量的增加導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，使酶活性下降，降低了對細(xì)胞的保護(hù)作用。值得注意的是，中棉所12的SOD活性并沒有一直低于中棉所35，說明單一的抗氧化酶活性變化還不能說明棉花耐鹽性的強弱，因為植物抗氧化系統(tǒng)包括酶系統(tǒng)(CAT、POD、SOD等)和非酶系統(tǒng)(植物體內(nèi)一些還原性物質(zhì)如抗壞血酸、胡蘿卜素、谷胱甘肽等)［16］，另外一些小分子糖、多元醇、甜菜堿、脯氨酸等也有一定的清除細(xì)胞內(nèi)自由基傷害的作用［17］。

Thompson 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在有Fe2+等過渡金屬離子存在的條件下，H2O2可與O-2通過Harber-Weiss 反應(yīng)生成氧化能力更強的·OH，直接進(jìn)攻膜脂的不飽和脂肪酸，引發(fā)過氧化作用。而CAT可直接催化H2O2的分解，從而能有效地清除生物體內(nèi)的過氧化氫對生物分子的氧化作用，因此，生物體內(nèi)存在CAT是其保護(hù)自身免受·OH 毒害的關(guān)鍵。此外，POD亦能通過催化H2O2與其他底物反應(yīng)以消耗H2O2從而清除植物體內(nèi)的H2O2。

多位學(xué)者通過對基因轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn)，植物的耐鹽性在分子及生理水平上都是由復(fù)雜的機制來調(diào)控的［19］。某些基因型植物具有高效的信號感知能力并且在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變，使它們對環(huán)境脅迫具有適應(yīng)性和完全的耐受性。在本試驗中，可能由于耐鹽品種的耐鹽基因具有高效的信號感知能力，在鹽脅迫下CAT及POD活性提高更快，以減少自由基的傷害，從而表現(xiàn)出耐鹽品種的CAT和POD活性高于鹽敏感品種。在一定鹽濃度及一定時間內(nèi)，隨著鹽濃度的上升，機體內(nèi)的活性氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致CAT、POD的活性都有所上升，以此來清除棉花體內(nèi)多余的自由基，從而保護(hù)細(xì)胞膜的正常功能，以此保證機體的正常生長;超過一定的鹽濃度后，活性氧自由基越來越多，CAT、POD已不能有效清除體內(nèi)多余自由基，平衡被破壞，膜脂過氧化加劇，植株處于不正常生長的狀態(tài)，從而使CAT、POD的活性下降。鹽敏感品種中棉所12 在不同濃度鹽脅迫下CAT、POD活性的變化趨勢與中棉所35 基本保持一致，但是由于該品種的耐鹽性決定了CAT、POD活性在整體上低于中棉所35，說明對于同樣的外界環(huán)境，鹽敏感品種不如耐鹽品種更能有效清除自由基的毒害作用，棉花品種間耐鹽性差異與保護(hù)酶活性的變化密切相關(guān)［20］。

在鹽處理過程中SOD、CAT及POD的活性反應(yīng)整體上一致性，但是后兩種酶表現(xiàn)得更敏感些?？字斡械龋?1］的研究結(jié)果表明，在45 ℃高溫處理下，SOD的活性變化也不明顯。因此，結(jié)合我們的實驗結(jié)果來看，可能是由于SOD具有很強的抗逆性，鹽處理對SOD活性的影響較小，亦或是鹽處理的梯度過少。

本研究結(jié)果表明，分析鹽脅迫下抗氧化酶活性與棉花耐鹽性的關(guān)系時，不能以單一的某一種酶作為其耐鹽性指標(biāo)，SOD、CAT及POD的活性均與棉花的耐鹽性具有相關(guān)性。雖然在鹽脅迫下各種酶之間協(xié)同互作機理尚不能確定，但是這3 種酶對保護(hù)植物膜系統(tǒng)有著極其重要的作用，是防止作物在鹽脅迫條件下受到氧化傷害的重要因素，抗氧化酶系統(tǒng)中酶活性的提高是鹽害等逆境下的重要生理反應(yīng)。在后續(xù)試驗中需加大鹽濃度范圍，以及測定更多品種棉花的多種生理指標(biāo)，更加深入地研究鹽脅迫對棉花生理的影響。

中棉所35 母本為豐產(chǎn)品系中23021，父本為抗病、優(yōu)質(zhì)雜交材料(中棉所12 ×川1704)，與中棉所12 親緣關(guān)系很近，但是這兩份材料的耐鹽性狀有顯著的差別［8］。遺傳背景相似而耐鹽性差異顯著的原因很可能是，在配置組合的過程中發(fā)生了一些細(xì)微的基因組水平上的改變，而這些改變與其差異性狀包括耐鹽性關(guān)系密切。因此對中棉所35 和中棉所12 的SNP/InDel 進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果顯示，耐鹽品種中棉所35 和敏鹽品種中棉所12 具有較多的相似序列，但同時也都存在插入/缺失和點突變，推測不同的耐鹽性狀可能是由基因組的點突變、插入缺失等復(fù)雜突變事件所導(dǎo)致的;SNP/InDel 可能對耐鹽性狀有調(diào)控功能，甚至是耐鹽性狀的一個重要的影響因素。

［1］ 劉友良，汪良駒.植物對鹽脅迫的反應(yīng)和耐鹽性［M］//余叔文，湯章城.植物生理與分子生物學(xué).2 版.北京:科學(xué)出版社，1998:752-769.

［2］ 汪 斌，蘭 濤，吳為人.鹽脅迫下水稻苗期Na+含量的QTL定位［J］.中國水稻科學(xué)，2007，21(6):585-590.

［3］ 蔣玉蓉，呂有軍，祝水金.棉花耐鹽機理與鹽害控制研究進(jìn)展［J］.棉花學(xué)報，2006，18(4):248-254.

［4］ 潘喬丹，黃元河，杜清華，等.核桃根和枝不同極性成分的抗氧化活性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(10):262-264.

［5］ 石雪萍，李小華，楊愛萍.南京雨花茶中總黃酮提取以及DPPH自由基清除活性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(6):238-240.

［6］ 史 娟.山茱萸多糖的提取及清除自由基作用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(12):289-291.

［7］ MELONI D A，OLIVA M A，MARTINEZ C A，et al.Photosynthesis and activity of superoxide dismutase，peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress［J］.Environ Exp Bot，2003，49:69-76.

［8］ 張麗娜，葉武威，王俊娟，等.棉花耐鹽性的SSR 標(biāo)記研究［J］.棉花學(xué)報，2010，22(2):175-180.

［9］ 鄒 琦.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000:131-161.

［10］ PATERSON A H，BRUBAKER C L，WENDEL J F.A rapid method for extraction of cotton (Gossypiumspp.)genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1993，11(2):122-127.

［11］ 張 軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測［J］.棉花學(xué)報，2000，12(5):267-269.

［12］ 高秀蕊，崔艷麗，徐富華，等.過氧化氫酶對超氧化物歧化酶清除O-2作用的影響［J］.河北師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1995，19(4):59-62.

［13］ 王秀玲，程 序，謝光輝，等.NaCl 脅迫對甜高粱發(fā)芽期生理生化特性的影響［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2010，19(10):2285-2290.

［14］ 楊淑萍，危常州，梁永超.鹽脅迫對海島棉不同基因型幼苗生長及生理生態(tài)特征的影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2010，30(9):2322-2331.

［15］ SHALATA A，NEUMANN P M.Exogenous ascorbic acid (vitamin C)increases resistance to salt stress and reduces lipid peroxidation［J］.Journal of Experimental Botany，2001，52(364):2207-2211.

［16］ YASAR F，ELLIALTIOGLU S，YILDIZ K.Effect of salt stress on antioxidant defense systems，lipid peroxidation，and chlorophyll content in green bean［J］.Russion Journal of Plant Physiology，2008，55(6):782-786.

［17］ 廖 巖，彭友貴，陳桂珠.植物耐鹽性機理研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報，2007，27(5):2077-2089.

［18］ THOMPSON J E，LEGGE R L，BARBER R F.The role of free radicals in senescence and wounding［J］.New phytol，1987，105:317-344.

［19］ 化 燁，才 華，柏 錫，等.植物耐鹽基因工程研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41(10):150-156.

［20］ 馬 麗，侯振安，梁永超，等.NaCl 脅迫對棉花幼苗生理特性的影響［J］.石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，26(2):180-184.

［21］ 孔治有，劉葉菊，覃 鵬.人工加速老化對小麥種子CAT、POD、SOD活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響［J］.中國糧油學(xué)報，2010，25(10):24-27.