杜晨輝，翟世博，黃素云，吳紅萍

（海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海南?？?71158）

甲胺磷（Methamidophos MAP），是一種廣譜、高效、劇毒的有機(jī)磷殺蟲劑，主要用于水稻、棉花等農(nóng)作物蟲害防治[1].由于其高效的病蟲害防治特點(diǎn)，曾被長期、大量地使用，引起水體、土壤污染，嚴(yán)重破壞了環(huán)境生態(tài)平衡，同時危害到人畜健康[2].農(nóng)藥在環(huán)境中的降解主要包括水解、光降解和微生物降解三種途徑，其中微生物降解具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快和反應(yīng)專一性強(qiáng)的特點(diǎn)[3-4].因此利用微生物降解甲胺磷農(nóng)藥是解決甲胺磷使用帶來的環(huán)境污染的有效途徑，一直以來也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn).

海南省是農(nóng)業(yè)大省，地處熱帶與亞熱帶地區(qū)，氣候環(huán)境有利于病蟲害的發(fā)生，農(nóng)藥的使用不可避免，且對病蟲害的防治起著舉足輕重的作用，為我省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供了保障.但各種農(nóng)藥的使用也帶來了諸多的環(huán)境污染、生態(tài)平衡和人類健康的問題，嚴(yán)重影響我省建設(shè)生態(tài)省和國家熱帶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)基地的目標(biāo).

目前國內(nèi)外有關(guān)甲胺磷農(nóng)藥微生物降解的研究報道比較多，但海南省有關(guān)甲胺磷農(nóng)藥微生物降解方面的研究卻鮮見報道.本研究從長期施用甲胺磷農(nóng)藥的土壤環(huán)境中篩選到2 株甲胺磷降解菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，既豐富了“海島熱區(qū)”獨(dú)有的微生物資源，又為我省有機(jī)磷農(nóng)藥生產(chǎn)及使用過程中帶來的環(huán)境污染及農(nóng)產(chǎn)品安全問題的解決提供了基礎(chǔ)材料.

1 材料和方法

1.1 土壤樣本來源

土壤取自?？谑徐`山鎮(zhèn)桂林洋農(nóng)場長期施用甲胺磷農(nóng)藥的農(nóng)田土壤，采樣時樣地種植草莓和青菜.

1.2 農(nóng)藥及試劑

甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品由海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司提供，其他生化試劑購自海南天地科技有限公司，均為分析純.

1.3 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基[5]：NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O 5.0 g，NaCl 0.5 g，MnSO40.01 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，加蒸餾水至1L，pH 7.0；富集培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基滅菌后加入適量的甲胺磷，作馴化及篩選分離菌株用；種子培養(yǎng)基:酵母膏5 g，蛋白胨10g，NaCl 5 g，加水至1 L，pH7.0～7.2.固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L，以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min，備用.

1.4 降解菌的馴化、富集篩選

取土壤10 g于250 mL三角燒瓶中，加入含0.4g/L MAP 無機(jī)鹽培養(yǎng)基100 mL，搖床培養(yǎng)（30℃，180r/min）7d.以后按10%的接種量進(jìn)行馴化、富集培養(yǎng)，每次7d，共6 次，并逐步提高甲胺磷終含量至0.8、1.5、2.0、3.0 g/L.取最后一次富集液梯度稀釋至10-3，取稀釋液涂布于無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上（不加MAP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基作對照），挑取含甲胺磷的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長較好的菌株，LB純化后保藏備用[6].

1.5 甲胺磷降解率的測定

1.5.1 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用甲胺磷和靶離子形成穩(wěn)定黃色絡(luò)合物的性質(zhì)，采用分光光度法測定[7].

1.5.2 甲胺磷降解率的測定

取培養(yǎng)物，4500 r/min 離心10min，取上清液，參考文獻(xiàn)[7]測定甲胺磷濃度.降解率ρ=（C1-C2）/C1×100%式中，C1為甲胺磷的原始濃度；C2為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算所得的甲胺磷濃度.

1.6 降解菌株生物學(xué)特性的研究

1.6.1 菌株生長曲線的測定

1.6.1.1 種子液的制備

挑取降解菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)24h，離心后去上清，用無菌水洗滌2次后重懸，即為種子液.

1.6.1.2 降解菌生長曲線測定

按5%的接種量接種種子液分別于裝有100mL LB液體培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MAP含量為0.8g/L）的250 mL三角燒瓶中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng).分別每2h和4h取樣，測定OD600，連續(xù)測定24h和32h.

1.6.2 菌株對甲胺磷耐受性的測定

取保藏菌株，活化后劃線接種于含不同甲胺磷濃度（0.4、0.8、1.5、2.0、3.0、4.0 g/L）的固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌株生長情況.

1.6.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

采用單因子試驗方法，分別測定降解菌株在不同初始pH值（4、5、6、7、8、9、10）培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）、不同接種量（1、2、4、6、8、10%）培養(yǎng)24 h 后培養(yǎng)液OD600值，確定菌株在含1.5 g/L MAP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的最適培養(yǎng)條件.

1.6.4 菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜性試驗

挑取單菌落，劃線接種于含1.5 g/L 樂果和久效磷的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況.

1.6.5 菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

取保藏菌株活化，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，每24h傳代1次，連續(xù)傳25代.分別取第5、10、15、20、25 代菌株接種于種子培養(yǎng)液中，按1.6.1.1 方法制備種子液.按5%接種量接種于含1.5 g/L MAP的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)72 h，按1.5.2方法測定菌株的降解率.

1.6.6 菌株對常見抗生素敏感性

挑取單菌落，劃線接種于分別含20、50、100 μg/mL 的氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Kan）的LB 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌落生長情況，測定菌株對不同種類及濃度抗生素的敏感性.

1.6.7 金屬離子對菌株降解甲胺磷農(nóng)藥的影響試驗

挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)液中，按1.6.1.1 方法制備種子液.按5%接種量接種于添加0.05% Fe?Cl3、FeSO4、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、BaCl2、AgNO3的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中（MAP 終含量為1.5 g/L），37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，按1.5.2方法測定金屬離子對菌株降解甲胺磷的影響.

1.7 菌株的鑒定

菌株鑒定采用BIOLOG 鑒定系統(tǒng)，具體操作參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離及篩選

通過馴化、富集和篩選，分離純化到在甲胺磷無機(jī)鹽平板上生長迅速的菌株2株，編號分別為HK-1和GLY-1.

2.2 甲胺磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線及降解率

從圖2 可以看出，菌株HK-1 和GLY-1 在培養(yǎng)72h后甲胺磷降解率分別達(dá)到85.76%，80.23%.菌株對甲胺磷的降解隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，一方面可能和菌株需要逐漸生長環(huán)境并利用甲胺磷農(nóng)藥作為生長的碳源；另一方面可能隨著菌株的生長代謝產(chǎn)生的甲胺磷降解酶增加.當(dāng)菌體培養(yǎng)到一定量時，共同競爭有限的碳源和產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抑制了對農(nóng)藥的降解.

圖1 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of MAP

圖2 不同培養(yǎng)時間內(nèi)菌株降解甲胺磷Fig.2 Degradation of MAP in different time of the two strains

2.3 降解菌株的生長曲線

從圖3和圖4可以看出，菌株HK-1和GLY-1在LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)均比在富集培養(yǎng)液中培養(yǎng)較早進(jìn)入對數(shù)生長期，這和兩種培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分相關(guān).菌株在只含MAP 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，只能利用無機(jī)鹽作為碳源，且菌株需要一個適應(yīng)和調(diào)節(jié)過程，并誘導(dǎo)菌體內(nèi)降解酶的生成.隨著甲胺磷逐漸被降解，中間產(chǎn)物積累到一定程度后，菌體生長受到抑制，細(xì)菌生長變緩[9-10].

圖3 菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curve of the two bacterial strains in LB medium

圖4 菌株在含MAP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4 Growth curveof the two bacterial strains in enrichment medium

2.4 降解菌株對甲胺磷的耐受能力

從表1中可以看出，菌株HK-1和GLY-1的耐受甲胺磷農(nóng)藥的最大含量為3 g/L.若在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加大于3 g/L 的MAP，MAP 不但不能作為碳源被菌株利用，反而作為毒害物質(zhì)抑制菌株的生長.

表1 降解菌對甲胺磷的耐受能力的測定Tab.1 The test of tolerance concentration of stains to MAP.

2.5 降解菌株的最適生長條件

從圖5-圖7 可以看出，在最適MAP 濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（MAP 終含量為1.5g/L），菌株HK-1 和GLY-1的最適初始pH、最適接種量及最適培養(yǎng)溫度為7.0、4%～6%、25～30 ℃.從圖8可知，兩菌株均最適合在含1.5 g/L MAP 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長，菌株可以在充分利用該濃度下的MAP 作為唯一碳源生長，這可能和MAP 濃度過高時產(chǎn)生毒副作用和MAP 濃度過低導(dǎo)致碳源供給不足而影響菌株生長相關(guān).

2.6 菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜性

菌株在含1.5 g/L的樂果和久效磷的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上均能生長，說明菌株能夠利用樂果和久效磷作為唯一碳源生長，具有一定的有機(jī)磷農(nóng)藥降解的廣譜性.

圖5 pH對菌株生長的影響Fig.5 Effect of pH on strains growth

圖6 接種量對菌株生長的影響Fig.6 Effect of inoculation quantity on strains growth

圖7 溫度對菌株生長的影響Fig.7 Effect of temperature on strains growth

圖8 甲胺磷濃度對菌株生長的影響Fig.8 Effect of MAP concentration on strains growth

2.7 菌株的遺傳穩(wěn)定性

從表2 可以看出，不同世代的菌株對甲胺磷農(nóng)藥的降解能力與初始菌株的降解能力相差不大，并未出現(xiàn)因傳代而導(dǎo)致菌株甲胺磷降解能力降低或喪失的情況，說明這兩株菌遺傳穩(wěn)定性較好.

表2 菌株降解甲胺磷農(nóng)藥的穩(wěn)定性Tab.2 Degradation stability of the four strains

2.8 菌株對抗生素的敏感性

從表3 可以看出，兩株菌對測試的抗生素表現(xiàn)出不同程度的敏感性.其中，菌株HK-1 對氨芐青霉素（Amp）較敏感，低濃度氨芐青霉素即可抑制菌株的生長；對氯霉素（Cm）和卡那霉素（Kan）的敏感性一般，在低濃度下生長，但長速較慢，高濃度下不生長.菌株GLY-1 對氨芐青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）較敏感，只能在低濃度下生長；對氯霉素（Cm）的敏感性較弱，在低濃度下生長較好，當(dāng)含量為50 μg/mL時生長較差.

表3 兩株菌對抗生素敏感性試驗Tab.3 Antibiotics sensitivity test of the two strains

2.9 金屬離子對菌株降解能力的影響

從表4 結(jié)果可以看出，測試的金屬離子對菌株GLY-1 降解甲胺磷均有不同程度的抑制作用，抑制程度依次為：Fe3+＞Fe2+＞Zn2+＞Ag+＞Cu2+＞Mn2+＞Ba2+；測試的金屬離子中，F(xiàn)e2+和Cu2+促進(jìn)菌株HK-1降解甲胺磷，其他金屬離子則不同程度地抑制菌株HK-1 降解甲胺磷，抑制程度依次為Fe3+＞Ag+＞Zn2+＞Ba2+＞Mn2+.同一金屬離子對兩菌株降解甲胺磷產(chǎn)生不同的促進(jìn)或抑制作用，說明兩株菌產(chǎn)生的降解酶系不同.

2.10 菌株鑒定結(jié)果

根據(jù)Biolog 鑒定系統(tǒng)結(jié)果，菌株HK-1 與Biolog GENIII數(shù)據(jù)庫中的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的匹配程度（相似性）即SIM 值為0.507，離散程度（距離）即DIST 值為4.238；菌株GLY-1 與Bio?log GENIII 數(shù)據(jù)庫中的特瑞特西蒼白桿菌（Ochroba?trum tritici）的匹配程度（相似性）即SIM 值為0.719，離散程度（距離）即DIST值為3.972.根據(jù)Biolog鑒定系統(tǒng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即SIM＞0.5、DIST＜5，將菌株HK-1和GLY-1 初步鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosasp.）和特瑞特西蒼白桿菌（Ochrobatrum triticisp.）.

表4 金屬離子對菌株降解能力的影響Tab.4 Effect of metal ions on Strains’s degradation ability

3 結(jié)論

從長期施用有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤中篩選分離到2株甲胺磷降解菌，編號為HK-1和GLY-1，經(jīng)BI?OLOG 鑒定系統(tǒng)鑒定菌株HK-1 和GLY-1 分別為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosasp.）和特瑞特西蒼白桿菌（Ochrobatrum triticisp.）.兩菌株在含1.5 g/L MAP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h，甲胺磷降解率分別為85.71%和80.25%.兩菌株對甲胺磷的最高耐受含量為3 g/L，傳代菌株降解甲胺磷的穩(wěn)定性較好，且均能利用樂果和久效磷作為唯一碳源生長，具有一定的有機(jī)磷農(nóng)藥降解廣譜性.菌株在含1.5 g/L MAP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的最適初始pH、最適接種量及最適培養(yǎng)溫度分別為7.0、4%～6%、25～30 ℃，金屬離子的添加影響菌株降解甲胺磷的效率，菌株對常見抗生素的敏感性不同.

本研究經(jīng)馴化、富集、分離篩選到的2株甲胺磷高效降解菌株，為開發(fā)和利用微生物修復(fù)因有機(jī)磷農(nóng)藥生產(chǎn)和使用過程中帶來的環(huán)境污染問題的解決奠定基礎(chǔ).但這僅僅是研究的開始，后期將進(jìn)一步研究菌株降解甲胺磷農(nóng)藥的機(jī)制，分析降解的功能物質(zhì)，并挖掘功能基因，同時從生態(tài)學(xué)角度研究和構(gòu)建降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物群落.

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