趙念席, 沈廣爽, 石雪芹
(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,天津300071)
硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR)是高等植物氮代謝的關(guān)鍵酶。植物的氮源主要是無機(jī)氮化物,而無機(jī)氮化物中又以銨鹽和硝酸鹽為主,約占土壤含氮量的1% ~2%,植物吸收銨鹽后可直接用于氨基酸的合成,而如果吸收了硝酸鹽,則必須通過NR 進(jìn)行代謝還原才能被植物利用[1]。另一方面,因為NR 與植物吸收利用氮肥有關(guān),對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響,因而NR 活性被當(dāng)作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一,也可作為品種選育的指標(biāo)之一,因此關(guān)于NR 活性影響的研究也具有重要的實際應(yīng)用價值[2-4]。
基于NR 的重要性,多數(shù)高校會在本科植物生物學(xué)實驗中安排NR 活性測定,其中,實驗中一般都會重點強(qiáng)調(diào)NR 是一種誘導(dǎo)酶,通常在有NO-3存在時,會誘導(dǎo)NR 的活性,且光照能提高NR 活性。因此,在準(zhǔn)備實驗材料過程中,注重KNO3誘導(dǎo)過程和光照過程。但我們多年實驗經(jīng)驗證明:有許多植物材料經(jīng)誘導(dǎo)也很難檢測到NR 活性,還有一些材料非誘導(dǎo)對照組和誘導(dǎo)組NR 活性無顯著差別。因而,尋找并確定好的本科實驗材料成為本科實驗教學(xué)工作的一個關(guān)鍵點[5-6],如果選不對實驗材料會使整個實驗失敗,學(xué)生則不能準(zhǔn)確掌握知識點。然而,隨著科學(xué)的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步,關(guān)于NR 活性調(diào)節(jié)的可能機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究。結(jié)果表明:除受到NO-3 底物濃度、光,以及培養(yǎng)環(huán)境因子等方面的影響外[7-9];在植物N 代謝中,NH+4濃度對NR 活性也有影響,且對不同植物的影響方式并不一致[10-12],但關(guān)于遺傳因素對NR 活性的影響涉及較少,從而使得本科教學(xué)中將NR 活性的大小和誘導(dǎo)響應(yīng)作為一個普遍規(guī)律來講解,其實作為物種選育的指標(biāo)之一,NR 應(yīng)該會具有物種特異性和品系特異性。因此,對植物NR 活性的特異性的了解不僅對提高農(nóng)業(yè)施肥效率等方面具有重要作用,對學(xué)生探究其原因也具有興趣引導(dǎo)的作用。
隨著高校綜合性實驗的逐漸推進(jìn),以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維習(xí)慣,提高分析問題和解決問題的能力為出發(fā)點,我們在試驗教學(xué)改革中設(shè)置綜合實驗,檢測了不同植物硝酸還原酶對KNO3誘導(dǎo)的敏感性問題,并進(jìn)一步檢測了兩種N 源對其中3 種植物硝酸還原酶誘導(dǎo)敏感性的影響。
本文選擇小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、辣 椒(Capsicum annuum)、白 菜(Beassica pekinensis)、蘿卜(Raphanus sativus)、番茄(Lycopersicon esculintum)、油菜(Brassica campestris)作為本研究所用的實驗材料。
種子發(fā)芽3 ~4 周后,將這些植物幼苗移栽至1 L培養(yǎng)缸中1 ×Hoagland(缺N 素)營養(yǎng)液培養(yǎng),每種植物6 盆,其中3 盆用于NR 的誘導(dǎo),另外3 盆作為對照,分別作好標(biāo)記。
3 d 后,在9:00 ~10:00 中向誘導(dǎo)組處理溶液中加入6 mL 1 mol/L KNO3溶液,而向?qū)φ战M中加入6 mL蒸餾水,放置在人工光源400 μmol/(m2·s)下光照培養(yǎng),誘導(dǎo)硝酸還原酶活性。2 d 后14:00 ~16:00(選擇此時間段是希望與學(xué)生上課時間同步),用于硝酸還原酶活性的測定。
試劑配置參考高玉葆等[2]略作修改,其中磺胺和萘基乙烯胺溶液參考劉亞麗等[13]配置。
每種植物材料在不同處理條件下采集樣品3 份,采用離體法測定NR 活性。具體方法為:
(1)每組處理樣品分別隨機(jī)選取均勻植物葉片3份,每份0.5 g,于研缽中剪碎置低溫冰箱冰凍30 min,取出置于冰浴中并加少量石英砂及4 mL 提取緩沖液,研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移入離心管中,在4 ℃8 000 r/min 離心5 min,上清液即為粗酶提取液。
(2)從每份粗酶液中吸取2 個1 mL,其中一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和NADH 溶液(0. 1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液配制),進(jìn)行酶反應(yīng);另一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和0.1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液而不加入外源的NADH,作為參比。所有溶液混勻,在25 ℃保溫30 min。
(3)保溫結(jié)束后立即加入1 mL 1% 磺胺溶液終止酶反應(yīng),再加1 mL 0.2%萘基乙烯胺溶液,黑暗中顯色30 min 后(此次保溫時間與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定時的保溫時間需嚴(yán)格一致),過濾,以參比管為空白參比,測定酶反應(yīng)組濾色在540 nm 的光密度。
對番茄、辣椒和小麥實施不同的N 素培養(yǎng),營養(yǎng)液在1 ×Hoagland 營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上略作修改,其中包括以(NH4)2SO4作為N 源和以KNO3作為N 源2 種培養(yǎng)液,分別記作-N 和-N,每種植物在每種培養(yǎng)液下培養(yǎng)6 盆,其中3 盆用于硝酸還原酶的誘導(dǎo),另外3 盆作為對照,分別作好標(biāo)記,每種植物共培養(yǎng)12 盆,3 種植物共36 盆。3 d 后,實施1.3 節(jié)和1.4 節(jié)內(nèi)容。
將所得數(shù)據(jù)輸入Excel,借助SPSS 中的方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
對缺N 營養(yǎng)液中的植物材料進(jìn)行硝酸還原酶的誘導(dǎo),結(jié)果表明各材料間NR 活性有顯著差異。其中,除番茄外,其余6 中植物均誘導(dǎo)測得NR 活性;但是在這6 種測得NR 活性的植物材料中,僅有辣椒在未誘導(dǎo)組未檢測到活性,而其他5 種植物中均檢測到很高的NR 活性;活性大小方面6 種植物都很好,對于本科實驗來講都還比較合適(見表1)。
表1 不同植物硝酸還原酶活性的差異
選擇有代表性且在本科實驗教學(xué)中經(jīng)常使用的小麥、辣椒和番茄為實驗材料,研究不同N 源對NR 活性的影響。結(jié)果表明:2 種N 源對3 種植物KNO3誘導(dǎo)敏感性的影響具有物種特異性。對于番茄,在NH+4-N培養(yǎng)條件下,添加KNO3誘導(dǎo)能檢測到微弱的NR 活性,其他3種培養(yǎng)條件均未檢測到NR活性;對于辣椒來講,4 種處理均檢測到NR 活性,但在培養(yǎng)條件下,添加KNO3誘導(dǎo)對NR 活性無顯著提高,而-N 培養(yǎng)條件下,KNO3誘導(dǎo)能顯著提高NR 活性;對于小麥來講,4 種處理均檢測到NR 活性,培養(yǎng)-N 條件下,對照組檢測到很低的NR 活性,添加KNO3誘 導(dǎo) 能 顯 著 提 高 NR 活 性(達(dá) 8. 68 μg/(g·h));-N 培養(yǎng)條件下,未誘導(dǎo)組和添加KNO3誘導(dǎo)處理所得NR 活性接近,表明KNO3添加對在-N 培養(yǎng)的小麥NR 不能起到誘導(dǎo)作用。
表2 不同培養(yǎng)條件對番茄、辣椒和小麥硝酸還原酶活性誘導(dǎo)的差異
本研究結(jié)果證明:在誘導(dǎo)環(huán)境相對適宜并相同的情況下,物種的差異(即遺傳因素)對NR 誘導(dǎo)活性且決定性作用。本研究中辣椒(Capsicum annuum)在無KNO3的添加的對照組中未檢測到NR 活性,而在KNO3的添加的誘導(dǎo)組中檢測到很好的活性,從某種程度上能證明NO-3的誘導(dǎo)作用;此外,小麥(Triticum aestivum),大白菜(Beassica pekinensis),蘿卜(Raphanus sativus),玉米(Zea mays),油菜(Brassica campestris)在無KNO3添加的對照組中,仍能檢測出很高的NR 活性,表明NR 誘導(dǎo)中的作用不在于(至少不完全在于)通過影響KNO3的吸收,即已經(jīng)存在NR 活性的植物,在一定的環(huán)境條件下,即使無KNO3的添加也能維持其活性[14]。但本研究中多數(shù)物種在添加KNO3的誘導(dǎo)組,NR 活性顯著提高(見表1)。隨著科學(xué)研究的進(jìn)行,NR 作為誘導(dǎo)酶的定義(植物本身不含有,只有外加NO-
3 才能誘導(dǎo)生成)也需要通過正式的教科書進(jìn)行修訂。其實,林建明等[14]就對NR 的誘導(dǎo)機(jī)理提出過有兩種情況:①酶蛋白的重新合成(植物本身不含有,只有外加NO-3,才能誘導(dǎo)生成);②酶前體的活化(說明不一定需要外加NO-3,才能誘導(dǎo)生成)。另外,番茄在對照組和誘導(dǎo)組均未檢測到NR 活性,在其他研究中也有類似的實驗結(jié)果,如陶懿偉等[6]實驗中紫藤等6 種植物未檢測到NR 活性,隨著科學(xué)的進(jìn)步,相關(guān)機(jī)制會逐步清晰。
本研究結(jié)果證明:不同形態(tài)的氮素對植物體內(nèi)的NR 活性有不同的影響,可能表現(xiàn)為促進(jìn)、抑制或者無顯著影響,在相同的培養(yǎng)環(huán)境中,主要體現(xiàn)在物種水平上的差異。在本研究中有如下幾種情況:
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