劉敏，張淑平

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093;2.上海理工大學(xué) 理學(xué)院，上海 200093)

紫菜多糖的含量由于品種、生長環(huán)境和生長季節(jié)等不同而有很大差別。紫菜多糖主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖組成，是一種含糖醛酸的酸性異多糖。研究表明，紫菜多糖具有多種生物活性，具有很大的發(fā)展空間［1-3］。

多糖的傳統(tǒng)提取方法是水提法，已廣泛應(yīng)用，但具有耗時(shí)長、提取率低等缺點(diǎn)［4］。伴隨著多糖的深入研究，酶法提取多糖因其具有快速、高效、反應(yīng)時(shí)間短和易于控制等諸多優(yōu)點(diǎn)而被采用。

本研究以紫菜多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，酶添加量、提取溫度、提取時(shí)間和pH 為影響因素，采用響應(yīng)面分析法［5-7］優(yōu)化酶法提取工藝，確定最優(yōu)工藝參數(shù)，為紫菜多糖的應(yīng)用和發(fā)展提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

纖維素酶(U/g ＞150 000)，棗莊市杰諾生物酶有限公司;紫菜;苯酚、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純。

FA20O4N 型電子天平;HY3-01 型電熱恒溫水浴鍋;FD-2 型冷凍干燥機(jī);UV-160O 紫外可見分光光度計(jì);SHZ-D 循環(huán)水式真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法［8-12］

紫菜→烘干→粉碎→紫菜粉→加水→調(diào)節(jié)pH→加纖維素酶→水浴→90 ℃滅酶10 min→抽濾→濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40 min，50 ℃)→冷凍干燥→產(chǎn)品。

精確稱取紫菜干粉2 g，加入120 mL 蒸餾水。纖維素酶用量為1.5%，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為60 min，pH 為5.0。

多糖提取液稀釋50 倍，以苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖含量。紫菜多糖的得率按下式計(jì)算:

其中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 12. 7x－0.010 3，A 為吸光度值，C 為多糖濃度，V 為溶液體積，m 為原料質(zhì)量，50 為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量對(duì)紫菜多糖得率的影響

酶用量對(duì)紫菜多糖得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 酶用量對(duì)紫菜多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme loading on polysaccharide yield

由圖1 可知，纖維素酶用量在0.5% ～1.5%時(shí)，紫菜多糖得率隨酶用量的增大而上升;酶用量達(dá)到1. 5% 后，多糖得率基本趨于水平;酶用量為1.5%時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，為12.61%。酶濃度過高，可能會(huì)抑制酶的作用［13-14］。因此，1.5%為最佳酶用量。

2.2 提取溫度對(duì)紫菜多糖得率的影響

不同溫度對(duì)多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)紫菜多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield

由圖2 可知，溫度在40 ～50 ℃時(shí)，紫菜多糖得率隨著溫度的升高而增大，50 ℃時(shí)，達(dá)到最大，為13.52%;溫度在50 ～65 ℃時(shí)，紫菜多糖得率隨著溫度的升高而降低。因此，50 ℃為最佳溫度。

2.3 提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的影響

時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖3。

由圖3 可知，在20 ～60 min，紫菜多糖得率隨時(shí)間延長而增加，60 min 時(shí)達(dá)到最大，為12. 79%。60 ～100 min，紫菜多糖隨著時(shí)間的延長而降低。究其原因可能是:由于時(shí)間的延長，導(dǎo)致紫菜粘度增大，反而不利于紫菜多糖的提取。因此，60 min 為最佳酶解時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on polysaccharide yield

2.4 pH 對(duì)紫菜多糖得率的影響

不同pH 對(duì)多糖得率的影響見圖4。

圖4 pH 對(duì)紫菜多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on polysaccharide yield

由圖4 可知，紫菜多糖得率隨著pH 的增大先增加后降低。pH 在4.0 ～5.0 時(shí)，紫菜多糖得率隨之增加，pH 為5.0 時(shí)達(dá)到最大，為23.51%;pH 在5.0 ～6.0 時(shí)，紫菜多糖得率隨之降低。因此，5.0 為最佳pH。

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果［15］

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇纖維素酶用量(W/W)、提取溫度、提取時(shí)間、pH(W/V)4 個(gè)因素為影響因素，以紫菜多糖的得率為響應(yīng)值，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design for RSM

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

應(yīng)用Design-Expert 8.5 對(duì)表2 中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得出紫菜多糖得率的二次回歸方程為:

表3 為紫菜多糖得率的方差分析。由表3 可知，回歸方程的P ＜0.01，說明模型高度顯著。其中一次項(xiàng)B 的P=0.002 3 ＜0.01，表明溫度對(duì)紫菜多糖得率有極顯著影響;B2、C2、D2的P 值均小于0.05，表明因素對(duì)多糖得率的影響不是簡單的線性關(guān)系;失擬項(xiàng)P=0.069 0 ＞0.05，表明擬合度較好，該響應(yīng)面能夠較真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

根據(jù)上述回歸方程做出立體分析圖和等高線圖，見圖5 ～圖7。

圖5 酶用量、溫度立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.5 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of enzyme loading and temperature

由圖5 可知，隨著酶用量和溫度的增大，紫菜多糖得率先提高后下降。酶用量在1.2% ～1.8%，溫度在47 ～55 ℃時(shí)，紫菜多糖得率較高。

圖6 顯示酶用量和時(shí)間對(duì)紫菜多糖得率的交互作用影響。立體分析圖可以看出時(shí)間和酶用量對(duì)紫菜多糖得率的影響均呈拋物線趨勢(shì)。隨著酶用量和時(shí)間的增大，紫菜多糖得率隨之先提高后下降。由等高線圖可以看出，酶用量在1.2% ～1.8%之間，時(shí)間在55 ～65 min 之間時(shí)，紫菜多糖得率達(dá)到最大。由于等高線圖中，等高線形狀接近圓形，說明A、D 兩個(gè)因素交互作用不明顯。

圖6 酶用量、時(shí)間立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.6 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of enzyme loading and extraction time

圖7 溫度、pH 立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.7 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of temperature and pH

由圖7 可知，隨著溫度和pH 的增大，紫菜多糖得率隨之先提高后下降。當(dāng)溫度在49 ～53 ℃，pH在4.7 ～5.3 時(shí)，紫菜多糖得率達(dá)到最大。

圖8 溫度、時(shí)間立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.8 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of temperature and time

由圖8 可知，隨著溫度和時(shí)間的增大，紫菜多糖得率先提高后下降。當(dāng)溫度在49 ～53 ℃，時(shí)間在55 ～65 min 時(shí)，紫菜多糖得率達(dá)到最大。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用軟件分析得到纖維素酶輔助提取紫菜多糖的最佳酶用量為1.48%，溫度為51. 11 ℃，pH 為5.01，提取時(shí)間為60.48 min，紫菜多糖得率軟件預(yù)測(cè)值為22.95%。選擇最佳酶用量為1.5%，溫度為51 ℃，pH 為5.0，提取時(shí)間為60 min，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果多糖得率為19.46%，與預(yù)測(cè)值22.95%非常接近，說明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果是可行的。

3 結(jié)論

纖維素酶輔助提取紫菜多糖的最優(yōu)工藝條件為:最佳酶用量為1.5%，溫度為51 ℃，pH 為5.0，提取時(shí)間為60 min。在此條件下，多糖得率為19.46%。

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