段永波，趙豐蘭，宋運(yùn)賢，盛 瑋，薛建平(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮北235000)

作為生命科學(xué)的重要組成部分，基因工程與細(xì)胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程在分子、細(xì)胞、酶學(xué)、蛋白水平共同組成了現(xiàn)代生物工程。其通過將所需的生物遺傳物質(zhì)——脫氧核糖核酸(DNA)從供體生物分離出來，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行切割后連接至表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞并整合至其基因組，使得目標(biāo)基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而發(fā)揮其功能。自上世紀(jì)70年代誕生以來［1］，基因工程已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)保等各領(lǐng)域，在推動(dòng)現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用。

目前，基因工程已作為生物科學(xué)和生物工程專業(yè)的一門核心專業(yè)基礎(chǔ)課，在綜合性大學(xué)、農(nóng)業(yè)大專院校、師范和醫(yī)科大學(xué)等各類高校陸續(xù)開設(shè)。該課程的整條主線都是基于DNA水平的操作，基本屬于“無實(shí)物”教學(xué)，給課程學(xué)習(xí)帶來了很大難度。因此，基因工程實(shí)驗(yàn)就成了非常必要的輔助課，也是引導(dǎo)學(xué)生將理論知識(shí)應(yīng)用于實(shí)踐，培養(yǎng)科學(xué)分析思維能力和創(chuàng)新能力的一門方法學(xué)課程。因其要求學(xué)生具備生化及分子生物學(xué)基本知識(shí)和操作技能，單個(gè)試驗(yàn)中間有時(shí)間間隔，實(shí)驗(yàn)周期較長，涉及昂貴儀器和試劑的使用，給課程教學(xué)帶來很大挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程主要集中于基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證［2］，所開設(shè)實(shí)驗(yàn)常涉及一整套該課程實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括培養(yǎng)基配制和高壓滅菌等常規(guī)實(shí)驗(yàn)。原來該課程教學(xué)目的主要是驗(yàn)證基因工程操作原理，在創(chuàng)新研究方面的內(nèi)容不多。此外，驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以帶給學(xué)生創(chuàng)造性的“成就感”，實(shí)驗(yàn)過程多是填鴨式的被動(dòng)完成。這會(huì)導(dǎo)致學(xué)生完全機(jī)械性地“做實(shí)驗(yàn)”，以致教學(xué)效果不佳。為提高教學(xué)效果，培養(yǎng)實(shí)踐技巧和科學(xué)思維能力，針對(duì)高等院校農(nóng)林專業(yè)特點(diǎn)，筆者將系統(tǒng)工程與模塊化設(shè)計(jì)相結(jié)合，應(yīng)用于該課程教學(xué)并取得很好的教學(xué)效果。

1 課程建設(shè)思路與設(shè)計(jì)

該課程在淮北師范大學(xué)主要針對(duì)師范專業(yè)學(xué)生開設(shè)，多數(shù)學(xué)生在畢業(yè)后將從事高中生物教學(xué)。近年來，基因工程及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在高考中占有非常重要的地位。在開設(shè)此門課程之前，學(xué)生已經(jīng)累積了微生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等課程及其相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，該課程建設(shè)旨在保證學(xué)生在完全理解基因工程內(nèi)涵的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步培養(yǎng)學(xué)生的科研態(tài)度和創(chuàng)新思維。

該課程僅保留基因工程實(shí)驗(yàn)課程中“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”的經(jīng)典內(nèi)容［3］，在有限的課時(shí)內(nèi)完成了從目的基因克隆到載體構(gòu)建過程，并實(shí)現(xiàn)所構(gòu)建載體在植物中表達(dá)的整個(gè)過程?；趥鹘y(tǒng)實(shí)驗(yàn)課程中所獲結(jié)果直觀性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，筆者在教學(xué)中引入了啟動(dòng)子、報(bào)告基因和終止子3個(gè)元素，通過從植物基因組DNA中克隆啟動(dòng)子、相關(guān)質(zhì)粒中擴(kuò)增報(bào)告基因連接至表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)其在植物細(xì)胞中表達(dá)，讓學(xué)生完成從基因水平到蛋白表達(dá)水平整個(gè)過程，同時(shí)檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)，直觀地感受實(shí)驗(yàn)的魅力，提高教學(xué)效果。

整體實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)劃分為3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的模塊，每個(gè)模塊都可獨(dú)立考核，其后也能放置較長時(shí)間至下一個(gè)實(shí)驗(yàn)(圖1)。整個(gè)課程中學(xué)生將完成基因表達(dá)所需元件中啟動(dòng)子和基因的功能分析。同時(shí)，以水稻或玉米2中植物作為實(shí)驗(yàn)材料克隆啟動(dòng)子，還提供含β－1，4糖苷酶gus的大腸桿菌供克隆報(bào)告基因。讓學(xué)生提前查詢資料熟悉引物設(shè)計(jì)的原則及方法，親自設(shè)計(jì)PCR引物(包括在引物末端添加酶切位點(diǎn))，掌握?qǐng)?bào)告基因gus作用機(jī)理，并根據(jù)自身興趣選擇實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)而提高其完成實(shí)驗(yàn)的主動(dòng)性。

2 教學(xué)方案實(shí)施

圖1 整體教學(xué)設(shè)計(jì)流程

筆者以基因表達(dá)框?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn)，以報(bào)告基因?yàn)檠芯繉?duì)象，改變了傳統(tǒng)基因工程實(shí)驗(yàn)課程中實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要以電泳圖譜的單一形式呈現(xiàn)的缺點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果以報(bào)告基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)來呈現(xiàn)。同時(shí)，將系統(tǒng)工程和模塊化設(shè)計(jì)思路引入課程教學(xué)，形成整個(gè)課程于一個(gè)完整實(shí)驗(yàn)，又將其劃分為3個(gè)獨(dú)立模塊，既提高了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣，又解決了實(shí)驗(yàn)課時(shí)間安排的難題。采用小班教學(xué)模式，分2人一小組，保證師生間充分交流及學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的充分理解。

在介紹實(shí)驗(yàn)整體流程時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容創(chuàng)造問題情景，引導(dǎo)學(xué)生實(shí)驗(yàn)前查詢所設(shè)置問題可能出現(xiàn)的原因及解決辦法。比如:研究水稻及玉米等作物基因工程技術(shù)的目的、意義及發(fā)展方向，報(bào)告基因gus作用機(jī)理，電泳中EB染色原理，基因克隆及載體構(gòu)建過程中的難點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的原理等。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)課程均始終貫穿以學(xué)生為主，教師為導(dǎo)的教學(xué)思想。目前表達(dá)載體構(gòu)建中質(zhì)粒DNA提取、酶切、連接等操作都有相應(yīng)的試劑盒，因此將課程重點(diǎn)由原來的克隆驗(yàn)證轉(zhuǎn)到從目標(biāo)基因克隆直至在真核細(xì)胞中的表達(dá)上。

在開始各實(shí)驗(yàn)單元模塊前，介紹實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟，同時(shí)引出相應(yīng)的問題供學(xué)生討論。在目的基因PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)其所選植物研究意義進(jìn)行討論，最后教師總結(jié)，指出采用基因工程技術(shù)改良玉米和水稻等重要農(nóng)作物對(duì)保障人類糧食安全的重要意義。同時(shí)在PCR和酶切實(shí)驗(yàn)間歇增加了電子克隆知識(shí)介紹、引物設(shè)計(jì)方法及如何通過酶切位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因工程中的“剪切—拼接”過程，采用多媒體展示現(xiàn)代生物學(xué)知識(shí)發(fā)展的日新月異。這樣即可將學(xué)生興趣、理論知識(shí)和實(shí)踐很好地結(jié)合，使學(xué)生加深對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解，提高教學(xué)效果。

筆者以表達(dá)報(bào)告基因gus為目標(biāo)，讓每組同學(xué)都克隆啟動(dòng)子和目的基因這2個(gè)表達(dá)框中的重要元件，并在生菜中瞬時(shí)表達(dá)。提供給學(xué)生由筆者構(gòu)建的含有g(shù)us但無啟動(dòng)子的載體pCAMBIA1381，以及有CaMV35S啟動(dòng)子但不含報(bào)告基因的載體pCAMBIA1305.1。將所構(gòu)建的啟動(dòng)子及報(bào)告基因功能分析的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化生菜，會(huì)得到2組對(duì)照載體及上述所構(gòu)建載體。通過報(bào)告基因表達(dá)分析會(huì)得出這樣的結(jié)果:只有啟動(dòng)子或報(bào)告基因都不能表達(dá)，必須要2個(gè)元件同時(shí)存在才能檢測(cè)到外源基因表達(dá)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程中介紹的基因內(nèi)含子及表達(dá)框中終止子功能，學(xué)生即可直觀地理解基因表達(dá)框中各個(gè)元件的作用。

鼓勵(lì)學(xué)生以科技論文的形式完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括題目、作者姓名、摘要、引言、材料與方法、結(jié)果與分析、討論、參考文獻(xiàn)等內(nèi)容，重點(diǎn)注意結(jié)果分析與討論部分，以此加深對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解。強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)報(bào)告是課程考核的重要部分，實(shí)驗(yàn)操作完成不夠理想的學(xué)生也可以在此環(huán)節(jié)獲得好成績。

3 結(jié)語

基因工程實(shí)驗(yàn)課程涉及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多、周期長、實(shí)驗(yàn)結(jié)果感官性不強(qiáng)，給學(xué)生和教師都帶來了很大挑戰(zhàn)。筆者以基因表達(dá)框?yàn)榛A(chǔ)，引入啟動(dòng)子和報(bào)告基因2個(gè)元件，不僅讓學(xué)生同時(shí)完成2個(gè)元件的克隆及其各自在基因表達(dá)中的作用，還避免了外源蛋白檢測(cè)所需的蛋白抽提和Western blot等復(fù)雜且不易控制的操作。課程完成后，采用雙向選擇的方式引導(dǎo)學(xué)生參與基因工程技術(shù)方向的畢業(yè)設(shè)計(jì)與實(shí)踐。很多學(xué)生將該課程所學(xué)知識(shí)應(yīng)用到畢業(yè)論文中，也培養(yǎng)了學(xué)生的科學(xué)思維方法。

基因工程技術(shù)更新極快，但每項(xiàng)技術(shù)發(fā)明后生物技術(shù)公司就會(huì)在很短時(shí)間內(nèi)研制并發(fā)布相應(yīng)操作規(guī)程，因此未來基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)的主要目標(biāo)應(yīng)該轉(zhuǎn)向培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新創(chuàng)造能力。在今后課程改革中，筆者將嘗試以科研課題為載體，進(jìn)一步加深基因工程實(shí)驗(yàn)課程與學(xué)生畢業(yè)論文設(shè)計(jì)的結(jié)合，拓寬學(xué)生科研思維，以助于其今后從事教學(xué)、科研等工作。

［1］JACKSON D A，SYMONS R H，BERG P.Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40:circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli［J］.PNAS，1972，69(10):2904 －2909.

［2］盛小禹.基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1999.

［3］J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學(xué)出版社，2002.