王慰敏孫文欣錢海利王海娟張叔人林晨#

安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061

國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021

惡性腫瘤是當今危害人類健康的第二大疾病。隨著分子生物學技術的發(fā)展，腫瘤疫苗成為目前的研究熱點。腫瘤基因/DNA疫苗，是將編碼腫瘤抗原（相關/特異抗原）的基因克隆到真核表達載體上，然后將重組的質粒DNA導入機體內，讓外源基因在體內表達，產(chǎn)生蛋白抗原刺激機體免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應，增強機體的抗腫瘤能力。利用外源性腫瘤抗原基因能夠提高和誘導機體的特異性抗腫瘤免疫反應以靶向殺傷腫瘤細胞，有可喜的應用前景。但同時面臨一些亟待解決的問題，如有價值的目的基因少，單基因疫苗為主難以激發(fā)較強的免疫應答，腫瘤基因的免疫耐受等。以“腫瘤趨化抗原核酸疫苗”為構想，我們擬選擇應用前景較好的c-erbB-2（Her-2/neu）基因及p53基因作為抗原基因進行融合，并在其上游和下游分別連接趨化因子SLC和免疫球蛋白的Fc段基因形成SLC-HP-Fc融合基因，并以腺病毒作為基因治療載體，采用分子生物學手段構建攜帶融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc的重組腺病毒真核表達載體，為進一步研究該融合基因與腫瘤相關作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株、質粒 人胚腎293細胞、E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)及E.coli BJ5183甘油菌（本實驗室凍存）。pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N質粒（本實驗室孫文欣構建）、骨架質粒pAdEasy-1（本實驗室保存）、穿梭載體pShuttle-CMV-sig-Fc（中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所免疫室覃漢軍博士構建）。

1.1.2 試劑與耗材 細胞培養(yǎng)基DMEM（GIBCO BRL公司），胎牛血清（GIBCO BRL公司），Lipofectamine2000（INVITROGEN公司），限制性核酸內切酶KpnⅠ、PmeI、EcoRⅤ、PacI、BamHⅠ（Takara寶生物公司），RNA酶（Boehringer Mannheim公司），DNA聚合酶（Takara寶生物公司），pfu高保真DNA聚合酶（上海生工），dNTP（Boehringer Mannheim公司），oligo-dT（Promega公司），DNA快速純化回收試劑盒（博大泰克公司）。

1.2 方法

1.2.1 攜帶SLC-HP C-HP基因的腺病毒穿梭載體（p Shuttle-CMV-SLC-HP-Fc P-Fc）的構建及鑒定 分別將pShuttle-CMV-sig-Fc、pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N（C-N）用KpnⅠ和EcoRⅤ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，按照2:3的摩爾比混合，16℃下經(jīng)T4酶連接3～4 h。產(chǎn)物轉入DH5α感受態(tài)細菌，利用卡那霉素抗性LB平板于37℃下培養(yǎng)12～16 h。挑選單個抗性小菌落，在含卡那霉素的5 ml LB培養(yǎng)液中于37℃下振蕩過夜，擴增后使用堿裂解法小量提取質粒。經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定篩選pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc重組穿梭質粒。

1.2.2 BJ-Ad Easy asyTMTM細菌的構建及鑒定 在氨芐青霉素抗性的LB平板上于37℃下培養(yǎng)10～14 h，篩選含pAdEasy-1質粒的大腸桿菌DH10B甘油菌，擴增后使用堿裂解法小量提取質粒。用氯化鈣法將骨架質粒pAdEasy-1轉入BJ5183感受態(tài)菌中，在鏈霉素和氨芐青霉素雙抗性的LB平板上進行篩選，挑選較飽滿克隆小提質粒，應用λHindⅢ酶切鑒定，正確的細菌克隆命名為BJ-AdEasyTM細菌。

1.2.3 重組腺病毒AdEasy EasyTMTM-SLC-HP-Fc P-Fc的構建及鑒定 重組pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc質粒應用限制性內切酶PmeⅠ酶切線性化，經(jīng)酚、氯仿抽提后將2μl線性化穿梭質粒轉入200μl BJ-AdEasyTM感受態(tài)細菌中，后接種于含有卡那霉素抗性的LB平板并倒置，于37℃下培養(yǎng)16～20 h。挑選較小菌落于LB培養(yǎng)液中擴增后使用堿裂解法小量提取質粒并應用PacⅠ酶切鑒定。重組成功的腺病毒質粒轉入E.coli.DH5α擴增，用卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)后挑選抗性菌落，通過目的基因PCR及BamHⅠ酶切后電泳進行鑒定。并應用Vigrous質粒大量提取純化試劑盒大量提取并純化重組質粒DNA，保存于-20℃，以備細胞轉染。

1.2..44重組腺病毒的制備及鑒定 轉染前一天將人胚腎293細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，不加抗生素，當細胞生長至約為70%，使用脂質體Lipofectamine2000將線性化的重組質粒轉染293細胞。于37℃、5%CO2、含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉染后第三天分瓶，觀察細胞形態(tài)變化，當細胞完全出現(xiàn)病變效應時同時收集細胞及上清液。當大部分細胞出現(xiàn)病變效應時取等量的上清液和蛋白酶K混和液處理，利用腺病毒骨架質粒引物和SLC-HP特異性引物分別進行PCR鑒定重組病毒。

1.2..55重組腺病毒的擴增、純化及保存 將收集后鑒定正確的含有原代AdEasyTM-SLC-HP-Fc的293細胞在-80℃凍存1 h后于37℃溶解20 min，反復3次充分裂解細胞，在4℃下以12000 rpm/min離心10 min，收集上清液再次接種293細胞，細胞出現(xiàn)完全病變時離心棄去培養(yǎng)液，細胞團塊經(jīng)少量PBS重懸后于-80℃凍存。經(jīng)細胞反復凍融病毒液感染293細胞使重組腺病毒AdEasyTM-SLC-HPFc不斷得到擴增，并采用氯化銫梯度離心法純化腺病毒分裝到Eppendorf管中，加入10%甘油，保存于-80℃。

2 結果

2.1 腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-SLC-HP-FC的鑒定

含目的基因的質粒pcDNA3.1-SLC-Her-2/neu-P53-N（C-N）經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切后定向克隆入穿梭載體pShuttle-CMV-sig-Fc，構建重組質粒pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc，提取質粒DNA進行KpnⅠ和EcoRⅤ行雙酶切分析得到1.1 kb的SLCHP片段，表明目的片段已經(jīng)插入重組質粒（圖1）。

圖1 pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc的KpnⅠ/EcoRⅤ酶切

2.2 BJ-AdEasyTM細菌的鑒定

如圖2所示，將pAdEasy-1質粒轉入BJ5183感受態(tài)細菌中，經(jīng)抗生素平板篩選后提取質粒，應用λHindⅢ酶切后可見兩條帶，大條帶與pAdEasy-1骨架質粒大小相近，說明腺病毒骨架質粒pAdEasy-1已經(jīng)成功轉入BJ-AdEasyTM感受態(tài)細菌中。

圖2 BJ-AdEasyTM細菌的酶切鑒定

2.3 融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc 真核表達載體的構建及鑒定

穿梭載體pShuttle-CMV-SLC-HP-Fc轉入BJAdEasyTM細菌中，使腺病毒骨架質粒與穿梭質粒發(fā)生同源重組。提取克隆5、9、10質粒進行BamHⅠ酶切，經(jīng)電泳后得到大小為22 kb和11 kb的兩條帶（圖3）。同時對克隆5、9、10中目的基因SLC-HP進行PCR擴增鑒定，結果顯示克隆5、9同源重組的腺病毒質粒中有1.1 kb的條帶，說明同源重組成功，命名為AdEasyTM-SLC-HP-Fc質粒（圖4）；克隆10中無條帶，說明重組失敗。將重組質粒經(jīng)脂質體Lipofectamine2000轉染至293細胞，大約15天，細胞出現(xiàn)病變（圖5），說明此時細胞內已有成熟的腺病毒顆粒包裝并釋放入上清液中。收集包裝后釋放到上清液中的重組腺病毒進行PCR鑒定，利用腺病毒骨架質粒引物和SLC-HP特異性引物分別進行PCR鑒定。結果顯示腺病毒攜帶的目的基因SLC-HP的PCR檢測中出現(xiàn)1.1 kb條帶（圖6），表明AdEasyTM-SLC-HP-Fc已在293細胞內包裝成功。

圖3 Ad-SLC-HP-Fc-BJ5183細菌的酶切鑒定

圖4 目的基因PCR鑒定

圖5 轉染前后的293細胞（×100倍）

圖6 重組腺病毒中目的基因PCR鑒定

2.4 Ad Easy TM-SLC-HP-Fc病毒庫的建立

保留部分原代重組腺病毒，用原代AdEasyTMSLC-HP-Fc在293細胞中擴增后保留第一代至第五代的AdEasyTM-SLC-HP-Fc作為種子庫。用種子病毒庫中的AdEasyTM-SLC-HP-Fc進一步在293細胞中擴增并收集AdEasyTM-SLC-HP-Fc，構建工作病毒庫。而后用工作病毒庫中的AdEasyTM-SLCHP-Fc進一步擴增病毒，積累收集的病毒用于進一步實驗。

3 討論

隨著分子生物學領域的迅猛發(fā)展，特別是DNA重組技術及基因工程的發(fā)展，使得基因治療成為當下抗腫瘤治療的熱點之一?；蛑委熓菍⑼庠椿虿迦牒线m的表達載體，再以重組載體轉染靶細胞，使目的基因在靶細胞或體內高效表達，從而達到治療目的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤相關基因，且部分基因已經(jīng)在抗腫瘤研究的實驗階段甚至臨床階段取得了可喜成績。

Her-2/neu基因，是人類腫瘤中最常見發(fā)生變化的癌基因之一。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Her-2/neu基因的過度表達。研究表明人類腫瘤組織中約有30%存在c-erbB-2基因的高表達，且這種高表達和腫瘤的轉移行為及預后不良有關[1-4]。目前國內外對Her-2/neu基因的靶向抗腫瘤研究較多，其中單克隆抗體Herceptin已在臨床應用于乳腺癌。p53基因是臨床發(fā)現(xiàn)與腫瘤生長相關性最高的抑癌基因之一。野生型p53基因在細胞周期的調節(jié)、DNA的修復及細胞凋亡中起著關鍵作用[5]。很多研究已經(jīng)證明在腫瘤的發(fā)生過程中存在p53基因的變異及失活[6-7]。臨床試驗表明導入外源重組腺病毒rAd-p53對結腸癌、肺癌、卵巢癌及頭頸部腫瘤等有抗腫瘤作用[8-10]。鑒于c-erbB-2及p53基因與腫瘤發(fā)生的密切關系及各自靶向抗腫瘤研究所取得成績，本實驗室將二者進行基因融合形成HP融合基因，并聯(lián)合應用次級淋巴組織趨化性細胞因子（SLC）和IgG Fc的佐劑效應來增強機體對腫瘤抗原的反應性和免疫效應細胞的活性[11]。Sun[12]等將融合基因SLC-HP通過基因槍導入C57BL/6小鼠體內，結果顯示該基因對小鼠黑色素瘤的預防和治療有良好效果。為了使該融合基因更早應用于臨床發(fā)揮抗腫瘤作用，本研究采用技術較成熟的腺病毒作為基因導入宿主細胞的載體，構建了AdEasyTM-SLC-HP-Fc重組腺病毒真核表達載體。

腺病毒是目前基因治療最常用的載體之一，主要是其具有宿主范圍廣，可感染分裂和非分裂細胞、且感染能力強、滴度高、安全性佳，病毒基因組不整合宿主染色體，外源性基因目的蛋白表達水平高，基因容量較大以及可選擇型別多等優(yōu)點[13-15]。本實驗采用當今廣泛應用的AdEasy系，簡化了載體的構建過程，實驗周期短，對實驗設備要求不高，且利用兩步感受態(tài)轉化法在原核細胞E.coli BJ5183中完成同源重組，制備的BJ-Ad-EasyTM細菌可供同時制備多種重組腺病毒使用。AdEasyTM-SLC-HP-Fc在293細胞中包裝鑒定成功后并通過其擴增，建立了重組腺病毒AdEasyTMSLC-HP-Fc種子病毒庫和工作病毒庫，為該疫苗的進一步研究奠定了實驗基礎。

本研究成功地構建了腺病毒AdEasyTM-SLCHP-Fc真核表達載體，目前國內尚未有類似報道，為進一步通過動物實驗及臨床實驗探索一種高效而廣譜的抗腫瘤疫苗奠定了實驗基礎。

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