秦丹丹+許甫超+董靜+葛雙桃+李梅芳

摘要：通過同源比對，對大麥MBF1s基因進行了電子克隆，并通過生物信息學(xué)的方法對其及編碼蛋白質(zhì)進行了預(yù)測和分析。結(jié)果表明，克隆到大麥MBF1家族3個成員HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c，三者所編碼蛋白質(zhì)均包含典型的MBF1和HLH結(jié)構(gòu)域，無可識別的信號肽和跨膜區(qū)，均為親水性蛋白，含有數(shù)個可能的磷酸化位點。電子表達譜結(jié)果表明，3個成員在大麥的大部分組織器官中都有表達，而HvMBF1a和HvMBF1b對所分析的脅迫處理響應(yīng)不明顯，HvMBF1c的表達受各種處理的劇烈誘導(dǎo)，HvMBF1c可以作為大麥和其他作物抗逆性分子育種的重要候選基因。

關(guān)鍵詞：大麥;MBF1基因;電子克隆;生物信息學(xué)

中圖分類號：R857.3 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5276-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.059

Electronic Cloning and Bioinformatics Analysis of MBF1 Genes from Barley

QIN Dan-dan1，2，XU Fu-chao1，2，DONG Jing1，2，GE Shuang-tao1，2，LI Mei-fang1，2

（1.Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China;

2. Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064， China）

Abstract： Electronic cloning and bioinformatics analysis of MBF1 genes were studied and putative proteins were coded by them from barley. The results showed that three members of MBF1 gene family were cloned from barley，namely HvMBF1a， HvMBF1b and HvMBF1c. All of the three MBF1 proteins contained typical MBF1 and HLH conserved domains at N- and C-terminal，respectively.There was no recognized signal peptide or transmembrane region in these proteins.All of them were hydrophilic proteins，and harbored several phosphorylation sites. Silico analysis showed that the expression of the three HvMBF1s could be detected in most of the organs of barley，and the expression of HvMBF1a and HvMBF1b was not influenced by various stimuluses，while HvMBF1c showed quite different expression level under biotic and abiotic stresses， which could be used as an important candidate gene in molecular breeding of barley and other crops with improved stress tolerance.

Key words： barley; MBF1 gene; electronic cloning; bioinformatics

大麥?zhǔn)鞘澜绲谒拇蠊阮愖魑?，具有食用、飼用、釀造和醫(yī)用等多種用途。在基礎(chǔ)研究中，大麥也可以作為小麥的模式植物，為進行小麥相關(guān)研究提供可參考的信息。

MBF1s基因家族成員廣泛參與了植物的生長發(fā)育和抗逆性的產(chǎn)生，對MBF1（Multiprotein bridging factor 1）家族基因的研究始于蠶中[1]，最早被定義為Mediator of BmFTZ-F1 type 1，MBF1和MBF2形成的二聚體可以通過連接BmFTZ-F1和TATA-box結(jié)合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）增強后兩者之間的互作，從而激活FTZ基因的表達。研究表明，在行使功能過程中，MBF1主要是通過連接TBP和某種轉(zhuǎn)錄因子，激活依賴于該轉(zhuǎn)錄因子的下游基因的表達，因此被定義為Multiprotein Bridging Factor 1[2]。

不同物種中MBF1連接的轉(zhuǎn)錄因子可能不同，如在果蠅和蠶中都是核內(nèi)激素受體FTZ-F1[1]，在酵母和人類中則分別是GCN4[3]和Ad4BP/SF-1[4]。從酵母到人類，MBF1基因的序列都很保守[2]，且從原生生物到高等生物，MBF1和TBP互作的氨基酸是共進化的[5]。雖然MBF1家族基因最早在蠶中發(fā)現(xiàn)，但是對擬南芥中3個MBF1家族成員AtMBF1a、AtMBF1b和AtMBF1c的相關(guān)研究是最為詳細(xì)，對這3個基因的克隆、表達、功能、作用機理等各個方面進行了深入研究[6-13]。結(jié)果表明，從基因序列、對激素和脅迫的響應(yīng)情況等多方面來看，AtMBF1a和AtMBF1b具有很高的相似性，但是與另外一個成員AtMBF1c則差異較大[6，7]。擬南芥的3個成員廣泛參與了植物的種子萌發(fā)、葉片細(xì)胞周期和膨大等生長發(fā)育過程[8，9]，AtMBF1c的超表達還明顯增強了擬南芥植株對氧化脅迫、病原菌侵染、干旱脅迫和高溫脅迫的抗性[10，11]。AtMBF1a的超表達也可以增強植株對生物和非生物脅迫的抗性[12]。近年來，小麥中的該家族基因成員TaMBF1a[14]和TaMBF1c（待發(fā)表）也被相繼克隆，這些基因在小麥生物和非生物脅迫抗性的產(chǎn)生過程中也發(fā)揮了重要作用。在大麥中，還沒有關(guān)于該類基因的報道。

本研究通過同源比對，對大麥中MBF1s基因進行了電子克隆。通過生物信息學(xué)的方法對其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、電子表達譜等進行了預(yù)測和分析，為大麥和其他作物的抗逆性育種中應(yīng)用該類基因提供理論依據(jù)，為進一步進行大麥該家族基因的克隆和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?HvMBF1s基因的電子克隆

根據(jù)已報道的小麥TaMBF1s基因序列，在NCBI（www.NCBI.nlm.nih.gov）上通過Blast搜索與其高度相似的大麥EST序列，進行逐步拼接，用NCBI的ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）及同源比對確定大麥HvMBF1s的完整開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）序列。

1.2 ?HvMBF1s基因的內(nèi)含子分析及染色體定位

根據(jù)已獲得的HvMBF1s基因序列，在IBSC相關(guān)網(wǎng)站（http：//www.public.iastate.edu/～imagefpc/IBSC%20Webpage/IBSC%20Template-home.html）通過Blast搜索已公布的與之同源的大麥基因組序列，通過DNAMAN軟件將二者進行比對，從而分析HvMBF1s的內(nèi)含子分布，同時確定HvMBF1s所在的染色體。

1.3 ?HvMBF1s蛋白結(jié)構(gòu)和保守域分析

利用DNAMAN軟件對HvMBF1s基因所編碼的蛋白質(zhì)序列進行預(yù)測，在EXPASY（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）數(shù)據(jù)庫中分析HvMBF1s蛋白質(zhì)的分子量、等電點等基本理化特性。二級結(jié)構(gòu)分析包括信號肽預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、疏水性分析（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）、磷酸化位點分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和跨膜區(qū)分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站上進行HvMBF1s蛋白質(zhì)的保守域分析。

1.4 ?HvMBF1s蛋白的亞細(xì)胞定位分析

通過WoLF PSORT工具（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）基于HvMBF1s基因編碼的氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.5 ?HvMBF1s的電子表達譜分析

根據(jù)大麥MBF1家族各成員的基因序列，在NCBI上通過Blast獲得該基因?qū)?yīng)的大麥Unigene（www.NCBI.nlm.nih.gov/Unigen），從而分析該基因在大麥各組織器官中的表達特性。根據(jù)大麥MBF1家族各成員的基因序列在PLEXDB（http：//www.plexdb.org/index.php）中通過Blast獲得該基因?qū)?yīng)的大麥contig，從而分析該基因在不同試驗處理下（以生物和非生物脅迫為主）的表達特性。

1.6 ?與其他物種中同源基因比對分析

在NCBI以及PlantGDB（www.plantgdb.org）相關(guān)網(wǎng)站上，通過Blast獲得大麥近緣物種水稻、玉米、短柄草、小麥以及模式植物擬南芥的MBF1s基因序列，通過DNAMAN軟件翻譯后進行同源比對分析，通過ClustalX軟件構(gòu)建MBF1同源基因的進化樹，并通過DNAMAN軟件觀察結(jié)果，參數(shù)均使用缺省值。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?HvMBF1s基因的電子克隆和分析

根據(jù)已報道的TaMBF1a（GenBank：FJ800577）、TaMBF1b（GenBank：AK332013）、TaMBF1c（GenBank：GQ370008）基因序列，在NCBI上通過Blast搜索大麥EST序列，分別獲得一條與其高度同源的大麥EST序列，GenBank登錄號分別為AK355896、AK248947和AK365287。通過ORF finder程序，并與小麥、擬南芥同源基因進行比對，最終獲得大麥HvMBF1a（圖1A）、HvMBF1b（圖1B）和HvMBF1c（圖1C）基因的完整ORF，分別包含429、429和456個核苷酸（圖1）。

2.2 ?HvMBF1s基因的基因組序列分析和染色體定位

以已獲得的HvMBF1s基因序列為種子在IBSC相關(guān)網(wǎng)站上進行Blast，獲得與之高度同源的大麥基因組序列，其中，與HvMBF1a高度同源的基因組序列為morex_contig_1561549，與HvMBF1b高度同源的基因組序列為morex_contig_139927、morex_contig_85112和HVVMRXALLhA0042F23_c6，與HvMBF1c高度同源的基因組序列為morex_contig_1564662，分別位于大麥染色體2HL、3HS和7HL上。進一步分析發(fā)現(xiàn)，contig1561549和contig1564662已分別包含了HvMBF1a和HvMBF1c的完整ORF序列，而與HvMBF1b同源的3條基因組序列分別包含了該基因的部分序列，將這3條序列進行拼接，獲得了HvMBF1b的基因組序列。通過DNAMAN軟件進行基因序列比對，結(jié)果表明，HvMBF1a的基因組序列由4 943個核苷酸組成，包含4個外顯子，分別位于1～142、411～494、4 620～4 699和4 821～4 943核苷酸處，HvMBF1b的基因組序列包含3 470個核苷酸，4個外顯子分別位于1～142、2 292～2 375、3 186～3 265和3 348～3 470核苷酸處，而HvMBF1c不包含內(nèi)含子。進一步分析表明，HvMBF1a和HvMBF1b基因的多數(shù)內(nèi)含子邊界序列符合GT-AG原則，而且二者的外顯子長度一致。

2.3 ?HvMBF1s蛋白結(jié)構(gòu)和保守域分析

利用DNAMAN軟件對HvMBF1s進行翻譯，并在EXPASY網(wǎng)站上對HvMBF1s蛋白的基本理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，HvMBF1a編碼142個氨基酸，相對分子量為15.744 kD，等電點為9.91;HvMBF1b編碼142個氨基酸，相對分子量為15.668 kD，等電點為9.99;HvMBF1c編碼151個氨基酸，相對分子量為15.832 kD，等電點為10.35。

二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，3個HvMBF1s均不含有可識別的信號肽區(qū)域和跨膜區(qū)，三者均為親水性蛋白質(zhì)，含有數(shù)個可能的磷酸化位點，其中HvMBF1a的磷酸化位點包括6個Ser和3個Thr，HvMBF1b包括2個Ser和2個Thr，HvMBF1c包括2個Ser和3個Thr。

對獲得的大麥HvMBF1s氨基酸序列進行在線功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果表明，3個基因所編碼的氨基酸序列的N端和C端分別包含典型的MBF1和HLH結(jié)構(gòu)域，其中HvMBF1a的MBF1結(jié)構(gòu)域為第9至第79個氨基酸，HLH結(jié)構(gòu)域為第85至第135個氨基酸，HvMBF1b的兩個結(jié)構(gòu)域分別為9～79和87～138個氨基酸，HvMBF1c為7～78和85～137個氨基酸（圖2）。

2.4 ?HvMBF1s蛋白亞細(xì)胞定位分析

通過WoLF PSORT工具預(yù)測HvMBF1s蛋白的亞細(xì)胞定位信息，結(jié)果表明，HvMBF1a和HvMBF1b可能都位于細(xì)胞核中，而HvMBF1c可能位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 ?HvMBF1s基因電子表達特性分析

在NCBI和PLEXDB相關(guān)網(wǎng)站上通過Blast搜索HvMBF1s所對應(yīng)的Unigene和Contig，結(jié)果表明，大麥HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c所對應(yīng)的Unigene分別是Hv.3929、Hv.743和Hv.24460，所對應(yīng)的Contig分別是Contig2972_at、Contig2498_at和Contig18796_at。在相應(yīng)網(wǎng)站上分析大麥各成員的電子表達特性，從表1可以看到，在除花藥之外的其他組織器官中，均可以檢測到HvMBF1a和HvMBF1b的表達，HvMBF1c在花藥中的表達量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織器官中，但在愈傷組織、頂端分生組織和穗子中均檢測不到HvMBF1c的表達，在葉片中，HvMBF1c也只是微弱表達。從表2中可以看到，無論是白粉菌、赤霉病等病原菌侵染，還是在干旱、高溫、低溫等非生物脅迫處理下，HvMBF1c的表達變化都較大，而另外兩個成員對大部分的生物和非生物脅迫的響應(yīng)都較小。

2.6 ?HvMBF1s與模式植物及近緣物種的序列比對分析

對大麥3個成員編碼區(qū)之間的相似性進行了分析，結(jié)果表明，在核苷酸水平上，HvMBF1a和HvMBF1b相似性為77.16%，HvMBF1a和HvMBF1c 為49.57%，HvMBF1b和HvMBF1c為49.78%，氨基酸的相似性分別為80.28%、43.14%和43.79%。

進一步分析表明，大麥3個成員HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c與小麥中相應(yīng)成員TaMBF1a、TaMBF1b和TaMBF1c的編碼區(qū)在核苷酸水平上的相似性分別達97.90%、98.14%和92.78%，所編碼的氨基酸序列相似性分別達98.59%、100%、94.23%，與擬南芥中相應(yīng)成員AtMBF1a（NM_129829）、AtMBF1b（NM_115730）和AtMBF1c（NM_113358）的相似性分別達75.76%、72.73%和51.89%，氨基酸序列相似性分別為78.87%、77.46%、55.13%（圖2）。

通過Blast獲得了大麥其他近緣物種的MBF1s基因如下：ZmMBF1a（BT036744）、ZmMBF1b（NM_00

1138960）、ZmMBF1c（NM_001254920）、OsMBF1（NM

_001068182）、OsMBF1c（NM_001064509）、BdMBF1a（XM_003573722）、BdMBF1b（XM_003565251）和BdMBF1c（XM_003563646）。利用DNAMAN軟件對大麥及其近緣物種以及模式植物擬南芥MBF1同源基因的氨基酸序列進行比對和進化樹分析，也可以清晰地看到，MBF1s基因家族不同成員在各個物種中保守性很高，特別是MBF1和HLH兩個功能域（圖3）。從圖3中也可以看出，所有物種的MBF1c單獨聚為一類，擬南芥的另外兩個成員AtMBF1b和AtMBF1a聚為一類，而對于其他物種，同一物種中的MBF1a和MBF1b差別相對較大，而各物種間的相應(yīng)成員相似性卻很高（圖3）。

3 ?論討

本研究通過電子克隆獲得了大麥MBF1家族的3個成員HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c，對這3個基因的基因組序列進行分析發(fā)現(xiàn)，這3個成員與擬南芥相應(yīng)成員的基因結(jié)構(gòu)類似，其中1a和1b具有相似的基因結(jié)構(gòu)，不僅都包含3個內(nèi)含子，而且二者的4個外顯子長度一樣，而1c不包含內(nèi)含子[6]。進一步將大麥3個成員的基因序列進行比較發(fā)現(xiàn)，HvMBF1a和HvMBF1b在序列上也相對一致，而與HvMBF1c則差別較大。擬南芥中相應(yīng)成員的序列也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，AtMBF1a和AtMBF1b核苷酸相似性為84.28%，AtMBF1a和AtMBF1c之間為53.69%，AtMBF1b和AtMBF1c之間為57.27%[6]。

對3個成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析發(fā)現(xiàn)，三者均沒有跨膜結(jié)構(gòu)，且親水性較高，說明3個成員均不是膜蛋白質(zhì)。預(yù)測的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，HvMBF1a和HvMBF1b可能位于細(xì)胞核中，而HvMBF1c位于細(xì)胞質(zhì)中。雖然Sugikawa等[15]的研究表明，擬南芥的3個MBF1s都位于細(xì)胞核內(nèi)，但是更詳細(xì)的研究表明，正常條件下AtMBF1c位于細(xì)胞質(zhì)中，而在熱脅迫下AtMBF1c迅速從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到核內(nèi)[9]。小麥中的成員TaMBF1c具有與AtMBF1c類似的特性（待發(fā)表），暗示著在熱脅迫下，植物MBF1c可以與某個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。小麥中的另一個成員TaMBF1a則位于細(xì)胞核中[14]。3個大麥HvMBF1s蛋白質(zhì)中都存在數(shù)個磷酸化位點，有研究表明，馬鈴薯懸浮細(xì)胞在受到病原菌侵染時，在CDPK激酶的作用下，StMBF1的磷酸化增強[16]。因此，在某種刺激下HvMBF1s可能作為激酶的靶蛋白，通過磷酸化發(fā)揮作用。

從同源進化樹可以看出，植物中，特別是禾本科植物中，MBF1家族3個成員的序列在各個物種間都表現(xiàn)出了高度保守性，說明這些基因可能具有類似的功能?；蛟谀撤N處理下的表達變化可能暗示著該基因的功能，在各種生物和非生物脅迫下，HvMBF1a和HvMBF1b的表達變化不大，而HvMBF1c的表達受各種處理的影響。相關(guān)研究表明，干旱、高鹽、高溫、低溫、ABA和H2O2處理都不能改變AtMBF1a和AtMBF1b的表達[6]，小麥 TaMBF1a的表達受條銹菌以及抗病相關(guān)植物激素SA、ABA、乙烯的誘導(dǎo)[14]，水稻OsMBF1在干旱脅迫下上調(diào)表達[17]，馬鈴薯中StMBF1的表達受氧化脅迫的誘導(dǎo)[18]。擬南芥中AtMBF1c則廣泛參與了植物對各種脅迫和激素處理的響應(yīng)，干旱、高鹽和ABA處理可以輕微誘導(dǎo)AtMBF1c的表達，H2O2和高溫脅迫則分別引起AtMBF1c上調(diào)表達16倍和46倍，TaMBF1c的表達受乙烯合成前體ACC、H2O2、干旱誘導(dǎo)，而且高溫脅迫可以劇烈誘導(dǎo)小麥TaMBF1c[19]以及番茄LeMBF1c[20]的表達。功能研究結(jié)果表明，AtMBF1a的超表達不僅可以提高植株的耐鹽性，還可以提高植株抵抗蔗糖和病原菌侵染的能力[10]，TaMBF1a也可能與小麥抗病性的產(chǎn)生有關(guān)[14]。AtMBF1c[8]和TaMBF1c（待發(fā)表）的超表達都可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性，前者還可以通過增加病原相關(guān)蛋白質(zhì)如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等的表達，增強擬南芥對病原侵染的抗性，并可以通過積累脯氨酸來提高抗旱性[8]。

本研究中，HvMBF1c的表達在不同處理中的變化都較大，如在野生型以及攜帶了Mla6抗白粉病基因的細(xì)胞死亡突變體間（BB2）、高溫脅迫（BB102）、條銹菌侵染（BB49）、低溫脅迫（BB65、BB94）、干旱脅迫（BB84）等。由此推測，HvMBF1c在大麥抗逆性中，特別是抗病性和耐熱性，也將發(fā)揮重要作用，可以作為大麥抗逆性分子育種的重要候選基因。

4 ?結(jié)論

本研究通過同源比對和電子克隆得到了大麥MBF1家族3個成員HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c，3個基因ORF分別包含429、429和456個核苷酸，編碼142、142和151個氨基酸，分別位于大麥染色體2HL、3HS和7HL，與小麥中相應(yīng)成員的編碼區(qū)在核苷酸水平上的相似性分別達97.90%、98.14%和92.78%。其中HvMBF1a和HvMBF1b包含3個內(nèi)含子，HvMBF1c不包含內(nèi)含子。3個基因所編碼蛋白質(zhì)均包含典型的MBF1和HLH結(jié)構(gòu)域，無可識別的信號肽和跨膜區(qū)，均為親水性蛋白，含有數(shù)個可能的磷酸化位點。電子表達特性分析結(jié)果表明，3個成員在大麥的大部分組織器官中都有表達，而HvMBF1a和HvMBF1b對所分析的脅迫處理響應(yīng)不明顯，HvMBF1c的表達受各種處理的劇烈誘導(dǎo)，因此推測HvMBF1c可以作為大麥抗逆性分子育種的重要候選基因。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）