文∕賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

1 方法原理

牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物經(jīng)乙腈提取，正己烷脫脂后，經(jīng)C18凈化小柱凈化，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭?；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。

青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮對(duì)照品（純度均大于95.0%）；乙腈（色譜純）；正己烷；甲酸（色譜純）。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取適量的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮，用50%乙腈水溶液溶解稀釋，分別配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4 ℃下保存，有效期為1 周。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取0.1 mL的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻即得。4 ℃下保存，有效期為1 周。

3 儀器和設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源，美國(guó)Waters公司，Waters Quattro Premier XE）；分析天平（感量0.00001 g）；天平（感量0.01 g）；高速離心機(jī)；渦旋混合器；水平振蕩器；固相萃取裝置；BakerBond C18固相萃取柱（500 mg/6 mL，或相當(dāng)者）；氮吹儀；濾膜（0.22 μm）。

4 試驗(yàn)方法

4.1 試驗(yàn)儀器條件

4.1.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：0～1 min，維持5%A；1～2.5 min，5%A線性變化至50%；2.5～4 min，維持50%A；4～5 min，維持5%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

4.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓：3.2 kV；源溫：110 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：650 L/h；測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 13 種β-內(nèi)酰胺類藥物定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量

4.2 樣品前處理

4.2.1 提取

稱?。?±0.02）g牛奶樣品，置于50 mL離心管內(nèi)，加乙腈8 mL，渦旋混合后，中速振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液于另一個(gè)50 mL離心管內(nèi)，加正己烷5 mL，渦旋混合后中速振蕩5 min，5 000 r/min離心5 min，棄上層有機(jī)相，下層溶液作為備用液。

4.2.2 凈化

C18小柱依次用乙腈5 mL、水10 mL活化，取全部備用液過(guò)柱同時(shí)收集于15 mL玻璃試管內(nèi)，擠干，于40 ℃下氮?dú)獯抵馏w積小于1 mL。加水定容至1 mL，充分渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管內(nèi)，15 000 r/min離心10 min，取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

4.2.3 測(cè)定法

取試料溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法計(jì)算。試料溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮的特征離子質(zhì)量色譜峰面積均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試料溶液中的離子相對(duì)豐度與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子相對(duì)豐度相比，符合表2的要求。

表2 試料溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍

4.2.4 結(jié)果計(jì)算和表述

或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)：由As＝aCs＋b，

式中：

X——供試試料中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量（μg/kg）；

Cs——基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物濃度（ng/mL）；

C——供試試料溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物濃度（ng/mL）；

As——基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物峰面積；

A——供試試料溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物峰面積；

V——濃縮后定容體積（mL）；

m——供試試料質(zhì)量（g）。

注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

4.3 線性范圍

分別準(zhǔn)確量取13 種β-內(nèi)酰胺類藥物系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，依次加入空白組織經(jīng)提取、凈化及濃縮后的溶液中，加水定容至1 mL，充分混勻，制得濃度為5、10、50、100、200和500 ng/mL的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，離心過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？瞻着Ｄ袒|(zhì)匹配得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）見(jiàn)表3。從中可以看出：13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在5～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.990。

表3 13 種β-內(nèi)酰胺類藥物回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）

4.4 方法的靈敏度

空白試樣按相同的步驟處理后進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試樣對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾。檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）：添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品，經(jīng)提取凈化后測(cè)定，根據(jù)所測(cè)藥物的S/N＞3（按PtP算）為方法檢測(cè)限，S/N＞10（按PtP算）為方法定量限的原則，測(cè)得青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮13 種藥物在牛奶中的檢測(cè)限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

4.6 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度考察

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶中添加低、中、高3個(gè)不同濃度的13 種β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5 個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，匯總結(jié)果見(jiàn)表4。從表中試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本方法在空白牛奶中進(jìn)行2～300 ng/g添加濃度檢測(cè)，方法的回收率為70%～120%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

表4 空白牛奶中13 種β-內(nèi)酰胺類藥物添加回收率試驗(yàn)（n=5）

5 結(jié)果與討論

5.1 線性范圍

空白基質(zhì)中13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。

5.2 靈敏度

青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮在牛奶中的檢測(cè)限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

5.3 精確度

在牛奶添加濃度為2～50 μg/kg范圍內(nèi)，本方法的回收率為70%～120%；批內(nèi)、批間RSD均小于20%。

5.4 β-內(nèi)酰胺類藥物的殘留情況與研究檢測(cè)方法的意義

β-內(nèi)酰胺類藥物（β-lactams）具有自然界中鮮見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺基母核，其中發(fā)展迅速、品種較多的兩類是青霉素類（penicillins，PENs）和頭孢菌素類（cephalosporins，又稱先鋒霉素）。常見(jiàn)的青霉素類藥物包括天然的青霉素G（又稱芐青霉素）等以及半合成的阿莫西林、氨芐西林和苯唑西林等；頭孢菌素類藥物較青霉素類穩(wěn)定，具有過(guò)敏反應(yīng)低，殺菌力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，該類藥物品種繁較多，不斷更新，典型的有頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢唑啉等。

β-內(nèi)酰胺類藥物在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)上都是重要的一類抗菌藥物，應(yīng)用十分廣泛。由于過(guò)敏反應(yīng)及細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等原因，許多國(guó)家都對(duì)動(dòng)物使用該類藥物以及在動(dòng)物源食品中的殘留情況進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)控。歐盟、美國(guó)和我國(guó)等多個(gè)國(guó)家都制定了牛奶等食品中的最高殘留限量。β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析方法已有大量報(bào)道，主要有液相色譜法（HPLC）法、免疫分析法和微生物測(cè)定法等，本方法采用快速簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）法作為該類藥物的確證方法，以保障對(duì)該類獸藥的殘留監(jiān)控。

5.5 前處理?xiàng)l件的確定

對(duì)于β-內(nèi)酰胺類藥物的提取大多使用水和有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，有時(shí)還要加入鎢酸鈉、硫酸等無(wú)機(jī)酸來(lái)沉淀蛋白質(zhì)，但是一些天然的藥物，如青霉素G等不耐酸，在酸性條件下又易分解，因此最終試驗(yàn)中采用了1∶4的水和乙腈進(jìn)行提取的方法。為降低背景雜質(zhì)對(duì)分析物的干擾，常需做進(jìn)一步的凈化，常用的固相萃取柱為C18柱和HLB柱，本試驗(yàn)比較了Sep-pak、Supelco、Varian、BakerBond C18小柱和HLB小柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用填料致密的BakerBond C18小柱去除雜質(zhì)、凈化樣品的效果最好。

5.6 離子對(duì)的確定

根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證β-內(nèi)酰胺類藥物至少需要3 個(gè)識(shí)別點(diǎn)（IP），試驗(yàn)中分別選擇了母離子以及對(duì)應(yīng)的2 個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性依據(jù)，這樣，1 個(gè)母離子有1個(gè)IP點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的2 個(gè)子離子分別有1.5 個(gè)IP點(diǎn)，達(dá)到了4 個(gè)IP點(diǎn)，很好地滿足了歐盟有關(guān)法規(guī)的要求。

6 結(jié)論

通過(guò)線性范圍試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等認(rèn)為，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)速度較快、定性定量準(zhǔn)確、回收率較高，完全能滿足13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在牛奶中殘留檢測(cè)方法的要求。