文∕賈 濤
(北京市飼料監(jiān)察所)
牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物經(jīng)乙腈提取,正己烷脫脂后,經(jīng)C18凈化小柱凈化,取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜后,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
以下所用的試劑,除特別注明者外均為分析純?cè)噭?;水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。
青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮對(duì)照品(純度均大于95.0%);乙腈(色譜純);正己烷;甲酸(色譜純)。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL):準(zhǔn)確稱取適量的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮,用50%乙腈水溶液溶解稀釋,分別配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4 ℃下保存,有效期為1 周。
混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/mL):分別準(zhǔn)確吸取0.1 mL的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,混勻即得。4 ℃下保存,有效期為1 周。
超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源,美國(guó)Waters公司,Waters Quattro Premier XE);分析天平(感量0.00001 g);天平(感量0.01 g);高速離心機(jī);渦旋混合器;水平振蕩器;固相萃取裝置;BakerBond C18固相萃取柱(500 mg/6 mL,或相當(dāng)者);氮吹儀;濾膜(0.22 μm)。
4.1.1 液相色譜條件
色譜柱:BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%甲酸乙腈溶液,B相為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫:0~1 min,維持5%A;1~2.5 min,5%A線性變化至50%;2.5~4 min,維持50%A;4~5 min,維持5%A。流速:0.3 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。
4.1.2 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);電離電壓:3.2 kV;源溫:110 ℃;霧化溫度:350 ℃;錐孔氣流速:50 L/h;霧化氣流速:650 L/h;測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。
表1 13 種β-內(nèi)酰胺類藥物定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量
4.2.1 提取
稱?。?±0.02)g牛奶樣品,置于50 mL離心管內(nèi),加乙腈8 mL,渦旋混合后,中速振蕩5 min,10 000 r/min離心10 min。取上清液于另一個(gè)50 mL離心管內(nèi),加正己烷5 mL,渦旋混合后中速振蕩5 min,5 000 r/min離心5 min,棄上層有機(jī)相,下層溶液作為備用液。
4.2.2 凈化
C18小柱依次用乙腈5 mL、水10 mL活化,取全部備用液過(guò)柱同時(shí)收集于15 mL玻璃試管內(nèi),擠干,于40 ℃下氮?dú)獯抵馏w積小于1 mL。加水定容至1 mL,充分渦旋混勻,轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管內(nèi),15 000 r/min離心10 min,取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜后,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
4.2.3 測(cè)定法
取試料溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn),外標(biāo)法計(jì)算。試料溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮的特征離子質(zhì)量色譜峰面積均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試料溶液中的離子相對(duì)豐度與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子相對(duì)豐度相比,符合表2的要求。
表2 試料溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍
4.2.4 結(jié)果計(jì)算和表述
或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn):由As=aCs+b,
式中:
X——供試試料中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量(μg/kg);
Cs——基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物濃度(ng/mL);
C——供試試料溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物濃度(ng/mL);
As——基質(zhì)匹配溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物峰面積;
A——供試試料溶液中相應(yīng)β-內(nèi)酰胺類藥物峰面積;
V——濃縮后定容體積(mL);
m——供試試料質(zhì)量(g)。
注:計(jì)算結(jié)果需扣除空白值,測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示,保留三位有效數(shù)字。
分別準(zhǔn)確量取13 種β-內(nèi)酰胺類藥物系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL,依次加入空白組織經(jīng)提取、凈化及濃縮后的溶液中,加水定容至1 mL,充分混勻,制得濃度為5、10、50、100、200和500 ng/mL的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,離心過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線??瞻着D袒|(zhì)匹配得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)見(jiàn)表3。從中可以看出:13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在5~500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2均大于0.990。
表3 13 種β-內(nèi)酰胺類藥物回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)
空白試樣按相同的步驟處理后進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果表明:在相應(yīng)的保留時(shí)間,空白試樣對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾。檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ):添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品,經(jīng)提取凈化后測(cè)定,根據(jù)所測(cè)藥物的S/N>3(按PtP算)為方法檢測(cè)限,S/N>10(按PtP算)為方法定量限的原則,測(cè)得青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮13 種藥物在牛奶中的檢測(cè)限為1 μg/kg,定量限為2 μg/kg。
采用標(biāo)準(zhǔn)添加法,在空白牛奶中添加低、中、高3個(gè)不同濃度的13 種β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn),各濃度進(jìn)行5 個(gè)樣品平行試驗(yàn),重復(fù)3次,求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,匯總結(jié)果見(jiàn)表4。從表中試驗(yàn)結(jié)果可以看出,本方法在空白牛奶中進(jìn)行2~300 ng/g添加濃度檢測(cè),方法的回收率為70%~120%,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。
表4 空白牛奶中13 種β-內(nèi)酰胺類藥物添加回收率試驗(yàn)(n=5)
空白基質(zhì)中13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在5~500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)均大于0.990。
青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮在牛奶中的檢測(cè)限為1 μg/kg,定量限為2 μg/kg。
在牛奶添加濃度為2~50 μg/kg范圍內(nèi),本方法的回收率為70%~120%;批內(nèi)、批間RSD均小于20%。
β-內(nèi)酰胺類藥物(β-lactams)具有自然界中鮮見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺基母核,其中發(fā)展迅速、品種較多的兩類是青霉素類(penicillins,PENs)和頭孢菌素類(cephalosporins,又稱先鋒霉素)。常見(jiàn)的青霉素類藥物包括天然的青霉素G(又稱芐青霉素)等以及半合成的阿莫西林、氨芐西林和苯唑西林等;頭孢菌素類藥物較青霉素類穩(wěn)定,具有過(guò)敏反應(yīng)低,殺菌力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),該類藥物品種繁較多,不斷更新,典型的有頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢唑啉等。
β-內(nèi)酰胺類藥物在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)上都是重要的一類抗菌藥物,應(yīng)用十分廣泛。由于過(guò)敏反應(yīng)及細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等原因,許多國(guó)家都對(duì)動(dòng)物使用該類藥物以及在動(dòng)物源食品中的殘留情況進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)控。歐盟、美國(guó)和我國(guó)等多個(gè)國(guó)家都制定了牛奶等食品中的最高殘留限量。β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析方法已有大量報(bào)道,主要有液相色譜法(HPLC)法、免疫分析法和微生物測(cè)定法等,本方法采用快速簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)法作為該類藥物的確證方法,以保障對(duì)該類獸藥的殘留監(jiān)控。
對(duì)于β-內(nèi)酰胺類藥物的提取大多使用水和有機(jī)溶劑進(jìn)行提取,有時(shí)還要加入鎢酸鈉、硫酸等無(wú)機(jī)酸來(lái)沉淀蛋白質(zhì),但是一些天然的藥物,如青霉素G等不耐酸,在酸性條件下又易分解,因此最終試驗(yàn)中采用了1∶4的水和乙腈進(jìn)行提取的方法。為降低背景雜質(zhì)對(duì)分析物的干擾,常需做進(jìn)一步的凈化,常用的固相萃取柱為C18柱和HLB柱,本試驗(yàn)比較了Sep-pak、Supelco、Varian、BakerBond C18小柱和HLB小柱,結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用填料致密的BakerBond C18小柱去除雜質(zhì)、凈化樣品的效果最好。
根據(jù)歐盟2002/657/EC要求,要確證β-內(nèi)酰胺類藥物至少需要3 個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP),試驗(yàn)中分別選擇了母離子以及對(duì)應(yīng)的2 個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性依據(jù),這樣,1 個(gè)母離子有1個(gè)IP點(diǎn),對(duì)應(yīng)的2 個(gè)子離子分別有1.5 個(gè)IP點(diǎn),達(dá)到了4 個(gè)IP點(diǎn),很好地滿足了歐盟有關(guān)法規(guī)的要求。
通過(guò)線性范圍試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)等認(rèn)為,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)速度較快、定性定量準(zhǔn)確、回收率較高,完全能滿足13 種β-內(nèi)酰胺類藥物在牛奶中殘留檢測(cè)方法的要求。