包 健 蔡 旋 邵蒞宇 盛永帥 徐建雄

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

在正常的人和動物腸道中有一層微生物的存在，這個并未引起不正?；蛑虏〉奈⑸飳泳褪钦Ｎ⑸锶海鼈儗ζ渌拗鞣堑珶o害而且是必要的。隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)衰老與腸道菌群之間有著密切的聯(lián)系［1］。正常菌群與宿主、環(huán)境之間處于協(xié)調(diào)的、動態(tài)的平衡，正常菌群刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，清除體內(nèi)有毒物質(zhì)，具有抗衰老作用［2］，而衰老機(jī)體內(nèi)腸道菌群會相應(yīng)發(fā)生改變［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與腸道菌和上皮細(xì)胞間的黏附密切相關(guān)［4］。三葉因子家族(trefoil factor family，TFF)是動物上皮細(xì)胞表達(dá)的一種小分子蛋白質(zhì)，在進(jìn)化上具有高度的保守性［5］。三葉因子3(TFF3)是正常的胃腸黏膜結(jié)構(gòu)保護(hù)和損傷修復(fù)不可缺少的物質(zhì)［6］，并且與腸道菌群的黏附作用有關(guān)［7］。黏液素(mucin，MUC)是一個大分子糖蛋白家族，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它在上皮細(xì)胞表面形成一層選擇性分子屏障，并參與信號傳導(dǎo)［8］。MUC可以分為2個亞家族［9］:分泌型和跨膜型，黏液素3(MUC3)是典型跨膜型MUC，可以作為細(xì)胞表面受體或效應(yīng)器，傳導(dǎo)信號。研究表明腸道菌群與MUC3基因表達(dá)也有一定的關(guān)系［10］。

哺乳動物腸道內(nèi)細(xì)菌組成非常復(fù)雜。近年來，腸道菌群對機(jī)體健康和疾病的影響越來越受到人們的關(guān)注［11－12］，研究證明抗氧化劑對動物腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用［13］。N－乙酰半胱氨酸(NAC)是一種有效的抗氧化劑，能夠抑制自由基生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝，預(yù)防DNA的損傷［14］，在臨床和試驗(yàn)中都得到了廣泛的應(yīng)用。由于在現(xiàn)代條件下，絕大多數(shù)的微生物還無法培養(yǎng)，給菌群的研究帶來了障礙［15］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，不依賴微生物培養(yǎng)的分子生物技術(shù)如變性梯度凝膠電泳(DGGE)為研究胃腸道微生態(tài)提供了簡便的方法［16－17］。DGGE技術(shù)近年來逐漸被應(yīng)用于檢測人類［18－20］、牛、豬和雞等動物胃腸道主要細(xì)菌類群的多態(tài)性，其結(jié)果更加全面準(zhǔn)確地反映了復(fù)雜腸道微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性。

本試驗(yàn)采用D－半乳糖誘致衰老模型小鼠，通過飲水給小鼠服NAC，觀察NAC對衰老小鼠腸道菌群的影響，通過DGGE技術(shù)比較腸道細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和多樣性，并通過熒光定量PCR測定黏附相關(guān)基因的表達(dá)，探索NAC抑制小鼠衰老與腸道菌群改變間關(guān)系及其可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與分組

昆明種雄性小白鼠36只，體重(28±2)g，由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將小白鼠隨機(jī)分成3組，每組12只，分2籠飼養(yǎng)，每籠6只，3組分別為對照組、衰老組、NAC組。每天按500 mg/kg的劑量通過頸背部皮下給衰老組和NAC組小鼠注射D－半乳糖，每天給對照組注射相同劑量的生理鹽水。每2周給小鼠稱重并根據(jù)小鼠的重量來調(diào)整注射的劑量。所有試驗(yàn)動物均飼喂新鮮飼糧和飲用經(jīng)過高溫滅菌的蒸餾水，只在NAC組小鼠的飲用水中添加0.05%NAC。所有試驗(yàn)動物都飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院試驗(yàn)動物房內(nèi)，溫度保持在23～28℃，相對濕度為50%～60%，動物房保持光照、黑暗各12 h，自由采食和飲水，連續(xù)飼養(yǎng)56 d。

1.2 主要試劑和儀器

D－半乳糖購自上海生物工程有限公司，NAC購自美國sigma公司，谷胱甘肽過氧物化酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Taq酶、DNA轉(zhuǎn)錄酶購自大連寶生物工程有限公司，DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自美國Sigma公司，去離子甲酰胺購自上海生物化學(xué)試劑工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計(jì)購自尤尼科上海儀器有限公司，生物冷凍離心機(jī)及普通PCR儀購自德國Eppendoff公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及DGGE電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)56 d之后通過頸椎脫臼法將所有小鼠處死并迅速打開腹腔，結(jié)扎回腸兩端，在回腸末端剪一小口，將內(nèi)容物擠入已滅過菌的離心管中，腸壁組織經(jīng)滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后分裝于離心管中，樣品放于－80℃冰箱中凍存待測。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 衰老指標(biāo)

將小鼠的回腸壁組織從－80℃冰箱取出，用PBS溶解，然后在 10 000×g，4℃ 條件下離心10 min，取上清液，GSH-Px、CAT活性和 MDA 含量3個指標(biāo)均通過試劑盒測定，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。

1.4.2 回腸細(xì)菌總 DNA

將回腸內(nèi)容物從－80℃冰箱中取出，參照文獻(xiàn)［21］的方法進(jìn)行回腸菌群總DNA的提取，具體步驟如下:樣品于冰上解凍后4℃，9 000×g離心5 min，棄上清液。加入1 mL TN150(10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8)懸浮沉淀，稱取0.3 g粒徑為100μm 和0.1 g粒徑為500μm 已滅過菌的鋯珠，加入150μL Tris飽和酚，在珠磨儀上4 600×g勻漿2 min破碎樣品，冰上冷卻2 min，重復(fù) 3 次。經(jīng) Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)反復(fù)抽提，直至水相和有機(jī)相間的界面清晰為止，然后用2倍體積冰乙醇和1/10體積5 mol/L NaCl在－20℃條件下沉淀2 h，10 000×g離心10 min，去上清，用 70%乙醇洗滌沉淀 3次，晾干，用100μL無菌雙蒸水溶解DNA沉淀，將提取出的DNA用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度(OD)值，計(jì)算A260/280，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總DNA的質(zhì)量。

1.4.3 PCR-DGGE

PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)［22］，PCR反應(yīng)體系為50μL，組成如下:2.5 μL 模板 DNA，10 μmol/L上游引物 1μL(5'－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG－3')，10μmol/L下游引物 1μL(5'－ ATTACCGCGGCTGCTGG － 3')，5 μL dNTPS，0.5 μL TransTaqTMDNA 聚合酶，5 μL 無菌雙蒸去離子水的GC，Mg2+。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸 2 min，共 30個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。

采用Bio-Rad Dcode進(jìn)行DGGE。凝膠梯度為35%～65%，變性方向與電泳方向一致。100%變性溶液含7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。使用1×TAE緩沖液，60 V 60℃電泳10 h。電泳結(jié)束后用溴化乙錠(EB)浸泡10 min染色，通過Bio-Rad GS800 Calibrated Densitometer掃描成像，通過Qantity One軟件進(jìn)行相似性和多樣性分析［23－24］。

1.4.4 TFF3、MUC3 基因表達(dá)水平

采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定小鼠回腸中TFF3、MUC3基因表達(dá)水平。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)為參考基因，引物依據(jù)文獻(xiàn)［25－27］設(shè)計(jì)(表1)。先將小鼠回腸壁組織從－80℃冰箱中取出，提取總RNA，然后通過測定并計(jì)算A260/280檢測總RNA的純度。檢驗(yàn)之后進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20μL，組成如下:2 μL cDNA，10 μmol/L 上 游 引 物 0.4 μL，10 μmol/L下游引物 0.4 μL，7.2 μL ddH2O 和10μL SYBR Premix Ex Taq。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸32 s，共40個循環(huán)。采用定量PCR上的ABI SDS軟件通達(dá)Ct值來測定目的基因的表達(dá)。目的基因表達(dá)水平=2－ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct參考基因)試驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct參考基因)對照組。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次以上，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC對小鼠回腸壁組織衰老指標(biāo)的影響

從表2中可以看出，衰老組小鼠回腸壁中GSHPx活性顯著低于對照組(P＜0.05)，CAT活性低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)，MDA含量顯著高于對照組(P＜0.05)，說明小鼠造模成功。NAC組小鼠回腸壁中GSH-Px和CAT活性高于衰老組，但差異不顯著(P＞0.05)，MDA含量低于衰老組，但差異不顯著(P＞0.05)，說明 NAC能提高衰老小鼠抗氧化機(jī)能。

表2 NAC對小鼠回腸壁組織GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響Table 2 Effects of NAC on activities of GSH-Px，CAT and MDA content in ileum tissue of mice

2.2 小鼠回腸細(xì)菌總DNA

將提取完的小鼠回腸細(xì)菌總DNA用紫外可見分光光度計(jì)在A260/280條件下測定其OD值，對照組、衰老組和NAC組的測定結(jié)果都在1.7～1.9之間，瓊脂糖凝膠電泳顯示提取的總DNA符合試驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。

2.3 小鼠回腸菌群結(jié)構(gòu)

小鼠回腸內(nèi)容物DNA PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，所有樣本的PCR產(chǎn)物在目標(biāo)位置都能見到清晰的條帶，產(chǎn)物的大小約為178 bp，說明PCR成功擴(kuò)增出了試驗(yàn)所需片段。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products

將成功擴(kuò)增出的PCR片段進(jìn)行DGGE凝膠電泳，小鼠回腸細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)的DGGE圖譜如圖2所示，圖2中不同位置的條帶代表不同的優(yōu)勢細(xì)菌，亮度反映出細(xì)菌相對量的多少。從圖2中可以看出對照組和衰老組的菌群結(jié)構(gòu)是有很大差異的，對照組有很多條帶并且很明亮，說明正常腸道菌群結(jié)構(gòu)豐富，衰老組條帶與對照組比較有明顯差異，說明衰老組中優(yōu)勢菌群有所改變，圖2中標(biāo)明了明顯的差異條帶，衰老組的條帶1、3和4明顯比對照組相應(yīng)條帶要暗，條帶2明顯比對照組要亮，說明衰老會影響小鼠回腸的菌群結(jié)構(gòu)。從圖2中可以看到NAC組菌群結(jié)構(gòu)和衰老組比較差異較大，NAC組條帶3比衰老組要暗，條帶4比衰老組亮，說明NAC能影響衰老小鼠回腸的菌群結(jié)構(gòu)。從圖中發(fā)現(xiàn)NAC組條帶分布與對照組接近，說明NAC對衰老小鼠腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖2 DGGE凝膠電泳圖譜Fig.2 The graph of DGGE gel electrophoresis

將DGGE凝膠電泳圖譜用Qantity One(Bio-Rad)軟件進(jìn)行非權(quán)重配對法(UPGMA)相似性聚類分析，得到的結(jié)果如圖3所示，更進(jìn)一步證明了DGGE圖譜準(zhǔn)確性。從圖3中可以看出對照組、衰老組和NAC組的試驗(yàn)平行性都比較好，不同組之間差異明顯，從圖中看出衰老組與對照組進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，NAC組與對照組進(jìn)化關(guān)系較近，也說明3組小鼠的回腸菌群結(jié)構(gòu)確實(shí)有差異。

圖3 UPGMA相似性聚類分析Fig.3 Similarity clustering analysis of UPGMA

用Qantity One(Bio-Rad)軟件對DGGE圖譜進(jìn)行多樣性分析，分析所得的豐富度(S)、多樣性(H)及均勻性(E)的結(jié)果見表3，從表3中可知，衰老組小鼠腸道菌群豐富度顯著低于對照組(P＜0.05)，NAC組豐富度低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。NAC組小鼠腸道菌群豐富度相對衰老組有所升高，但差異不顯著(P＞0.05)。衰老組小鼠腸道菌群的多樣性和均勻性低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)，NAC組小鼠腸道菌群的多樣性和均勻性相比衰老組有所升高，但差異不顯著(P＞0.05)。這說明NAC能增加衰老小鼠腸道菌群多樣性。

表3 DGGE圖譜多樣性分析結(jié)果Table 3 Diversity analysis results of DGGE graph

經(jīng)測序后，用Blast工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行比對，結(jié)果如表4所示。腸道中的菌群與數(shù)據(jù)庫中的已知菌群序列有很高的相似性，都在99%以上。從表4和圖2中可知，相對于對照組，衰老組小鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌數(shù)量有所減少，大腸桿菌數(shù)量有所增加。NAC組小鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌數(shù)量比衰老組有所增加，大腸桿菌數(shù)量比衰老組有所減少。相比對照組，NAC組小鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸球菌數(shù)量有所減少，大腸桿菌數(shù)量有所增加。這說明NAC確實(shí)能改變衰老小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

表4 DGGE圖譜代表?xiàng)l帶序列比對Table 4 Sequence comparison of representative bands of DGGE graph

2.4 NAC對小鼠回腸壁組織 MUC3、TFF3基因表達(dá)水平的影響

通過熒光定量PCR測定小鼠回腸壁組織中MUC3和TFF3基因表達(dá)水平，測定結(jié)果如表5所示，從表5中可以看出衰老組小鼠MUC3基因表達(dá)水平顯著低于對照組(P＜0.05)，NAC組小鼠MUC3基因表達(dá)水平顯著高于衰老組(P＜0.05)，略高于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。衰老組小鼠TFF3基因表達(dá)水平顯著低于對照組(P＜0.05)，NAC組小鼠TFF3基因表達(dá)水平顯著高于衰老組(P＜0.05)，顯著低于對照組(P＜0.05)。這說明NAC調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)的機(jī)理可能與MUC3、TFF3基因有關(guān)。

表5 NAC對小鼠回腸壁組織MUC3、TFF3基因表達(dá)水平的影響Table 5 Effects of NAC on gene expression levels of MUC3 and TFF3 in ileum tissue of mice

3 討 論

腸道菌群是由種類繁多的大量微生物組成的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主的生長、發(fā)育、物質(zhì)代謝和衰老有著密切的關(guān)系。正常機(jī)體內(nèi)腸道菌群對機(jī)體有重要作用，能清除有害物質(zhì)，抵抗衰老。腸道菌群間互相保持著共生或拮抗關(guān)系，它們與宿主的健康、疾病有著極其密切的聯(lián)系［28］。

Harman［29］提出了衰老的自由基理論，他認(rèn)為衰老的過程歸咎于細(xì)胞和組織長期暴露于自由基的累積性損傷，體內(nèi)代謝過程產(chǎn)生的過剩自由基攻擊生物大分子(如DNA、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類)引發(fā)的氧化損傷是導(dǎo)致機(jī)體老化及許多的老年性疾病的主要因素［30］。NAC為谷胱甘肽的前體，是一種含有巰基的抗氧化劑［31］，能通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的生物合成而減少氧化損傷［32］。有研究表明NAC可阻斷細(xì)胞凋亡過程，并可以作為自由基的清除劑，干擾自由基的形成，從而抵抗衰老，如活性氧中間體(ROI)參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，NAC能將其清除［33］，NAC還可以干擾凋亡出現(xiàn)后下游的信號［34］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NAC能提高衰老小鼠抗氧化機(jī)能，與以往的報(bào)道一致。

大量研究結(jié)果表明，TFF3與腸道疾病間具有重要的關(guān)系，如TFF3分泌不足可能是導(dǎo)致早產(chǎn)兒和窒息兒更容易發(fā)生腸道黏膜損害的原因之一［35］;TFF3可降低血漿二胺氧化酶(DAO)活性，抑制腸道組織中腫瘤壞死因子 α(TNFα)的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，減輕脂多糖(LPS)所致幼鼠腸損傷，發(fā)揮保護(hù)作用［36］;TFF3通過腹腔和皮下注射可以減輕腸道的炎癥反應(yīng)，降低氧自由基損害［37］;TFF3還可以減輕三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病及腸黏膜炎癥病理性損傷并能促進(jìn)損傷的修復(fù)等［38］。腸道菌群對MUC的分泌具有刺激作用，如乳酸桿菌、雙歧桿菌等可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞MUC3分泌，減少致病性大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌對腸上皮細(xì)胞的黏附［39］。腸道致病菌侵入腸上皮細(xì)胞可通過破壞減少杯狀細(xì)胞的數(shù)量，從而減少M(fèi)UC的分泌量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示NAC能增加衰老小鼠腸道中的乳酸桿菌、雙歧桿菌等菌群，從而可提高M(jìn)UC3分泌來降低腸道致病菌。因此，NAC調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)理可能與TFF3和MUC3基因表達(dá)有關(guān)，對于NAC影響腸道菌群的深層機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

NAC能提高衰老小鼠抗氧化機(jī)能并且對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用。NAC通過抗氧化作用調(diào)節(jié)腸道菌群的機(jī)理可能與TFF3和MUC3基因表達(dá)有關(guān)。

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