孫盛明 謝 駿 朱 健 戈賢平 江曉浚

(1.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510380;2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，無錫 214081;3.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，無錫 214081)

隨著集約化養(yǎng)殖模式的擴大和推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了迅猛的發(fā)展。然而，因高密度養(yǎng)殖、投飼頻率增加以及水體污染等問題，導(dǎo)致水生動物的病害和重大疫病頻發(fā)。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害平均年損失達百億元，其中魚類占55%～77%，蝦蟹類占 11% ～28%［1］，通過營養(yǎng)學手段從根本上增強水生動物自身免疫力成為健康養(yǎng)殖領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵問題。新型綠色水產(chǎn)飼料添加劑寡糖又稱低聚糖或寡聚糖，是由2～10個單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合體，由于單糖分子大小和結(jié)構(gòu)不一，單糖之間的結(jié)合方式不同，構(gòu)成性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能不盡相同的眾多種類的寡糖類物質(zhì)，包括甘露寡糖(mannan oligosaccharide，MOS)、果寡糖(frueto oligosaeeharides，F(xiàn)OS)、半乳甘露寡糖(galactomannan oligosaccharides，GMOS)等。近年來，甘露寡糖在畜禽養(yǎng)殖中被認為具有提高生產(chǎn)性能、優(yōu)化腸道微生物區(qū)系及增強機體免疫力的作用［2－3］，然而，甘露寡糖對水生動物是否具有相似作用效果尚無定論。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)，隸屬于硬骨魚綱，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鳊 亞 科(Abramidinae)，魴 屬 (Megalobrama)，其肉質(zhì)鮮美、生長快、經(jīng)濟價值高，截至2011年，團頭魴在我國的總產(chǎn)量遠超過60萬t，是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一［4－5］。迄今，在魚類飼料中添加甘露寡糖的研究較少，僅見雜食性魚類異育銀鯽［6］、鯉［7］和肉食性魚類虹鱒［8］、金頭鯛［9］等少數(shù)品種，甘露寡糖在草食性魚類團頭魴養(yǎng)殖中的應(yīng)用還未見報道。本試驗選用團頭魴幼魚為研究對象，在研究甘露寡糖對團頭魴幼魚生長性能、抗氧化能力影響的基礎(chǔ)上，采用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)探討甘露寡糖對團頭魴幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為甘露寡糖在團頭魴健康養(yǎng)殖中合理利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

團頭魴幼魚購自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地。選擇活潑健康、規(guī)格一致、平均體重為(1.05±0.01)g 的團頭魴幼魚360尾，隨機分成4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。試驗魚以重復(fù)為單位放入流水循環(huán)圓形蓄養(yǎng)槽(體積約為300 L)內(nèi)，各組試驗所用蓄養(yǎng)槽在空間位置上隨機排布，以減小各組間因光線等因素造成的誤差。試驗開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)2周后，按照日投喂量為試驗魚體重的3%～5%投喂5種試驗飼料，每天投喂 3次(08:00、11:30和17:00)，根據(jù)攝食情況適當調(diào)整投喂量。整個試驗期間水質(zhì)如下:水溫為27～29℃，溶氧濃度≥5 mg/L，氨氮濃度≤0.05 mg/L，pH 為 6.8～ 7.2。試驗期為8周。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，禁食24 h后量取魚體長、稱魚體重，以計算生長性能指標。每個重復(fù)取3尾，每個組的9尾團頭魴幼魚分別取腸道組織，在生理鹽水中洗滌，除去其上所帶有的血液、糞便等雜質(zhì)，用液氮速凍后于－80℃保存用于腸道菌群結(jié)構(gòu)分析;取魚體的肝臟組織－80℃放置，用于抗氧化指標測定。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 生長性能的測定

增重率(weight gain rate，WGR)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)、成活率(survival rate，SR)用以下公式求得:

1.4 肝臟抗氧化指標的測定

肝臟樣品解凍后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重。肝臟與預(yù)冷的生理鹽水按1∶9(質(zhì)量體積比)的比例冰浴勻漿，然后在4℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液用于抗氧化指標分析。肝臟上清液蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量分別采用黃嘌呤氧化酶法、吸光光度法和硫代巴比妥酸法測定，所用試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.5 DGGE技術(shù)分析腸道菌群結(jié)構(gòu)

1.5.1 DNA提取方法和高可變區(qū) 16S rDNA-V3片段的PCR擴增

按照蛋白酶K－氯仿－異戊醇法從腸道內(nèi)容物提取DNA。本試驗采取將DNA提取物稀釋100倍的純化方法。按文獻［10］提供的擴增方法，采用帶GC夾(GC-clamp)細菌通用引物341F(5'－CCTACGGGAGGCAGCAG－3')和 534R(5'－ATTACCGCGGCTGCTGG－3')進行細菌基因組DNA的擴增，GC-clamp序列為 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGGGG，擴增片段為細菌的16S rDNA-V3片段。PCR擴增采用 50μL體系，包括 10×LAPCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，10 mmol/L dNTP 4μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，5 U/μL LATaq DNA 聚合酶0.5 μL，50 ng/μL 模板 DNA 2.0 μL，滅菌去離子水 37.5 μL。整個過程采用降落PCR(touchdown-PCR)模式，程序如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，之后每個循環(huán)退火溫度降低0.5℃，循環(huán)20次，在這個退火溫度下再進行15個循環(huán);72℃最終延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠中回收純化PCR產(chǎn)物，采用大連寶生物工程公司的膠回收純化試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit)進行，過程參照試劑盒中的使用說明進行操作。

1.5.2 PCR 擴增產(chǎn)物的 DGGE

將PCR擴增產(chǎn)物通過DGGE進行分離，采用的凝膠變性梯度為35%～55%，濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學變性劑為100%尿素7 mol/L和40%的丙烯酰胺)，在 1×TAE緩沖液中 150V 60℃下電泳5 h，電泳完畢后采用銀染的方法進行染色，銀染結(jié)束后利用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

2.3 兩組患兒心律失常情況 對照組患兒心律失常發(fā)生率為62.5%(25/40)，觀察組為29.3%(12/41)，觀察組明顯低于對照組(χ2=7.684，P<0.05)，見表2。

1.5.3 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的克隆及測序

PCR回收純化產(chǎn)物與pMD18-Tvector(TaKa-Ra)在16℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，藍白斑篩選挑選陽性克隆子，電泳檢測確認陽性克隆。最后將所得克隆片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行處理，若差異顯著，再進行Tukey’s多重比較，顯著水平為P＜0.05，所有結(jié)果均以平均值±標準誤(mean±SE)表示。

用Quantity One 4.6軟件分析樣品電泳條帶的數(shù)目和亮度，以此來評估腸道菌群的生物多樣性，生物多樣性采用Shannon-Wiener指數(shù)表示，該指數(shù)可以表示種群之間遺傳多樣性的分布和差異。其公式為:

式中:H'代表Shannon-Wiener指數(shù);ni代表某泳道中單個條帶的平均密度;N代表該泳道下所有條帶的密度和，用來評估各樣品的多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚生長性能的影響

由表2可知，在養(yǎng)殖8周結(jié)束后，團頭魴幼魚攝食添加了甘露寡糖的飼料后增重率、飼料系數(shù)和成活率均沒有產(chǎn)生顯著變化(P＞0.05)，其中100和200 mg/kg甘露寡糖組的增重率略高于對照組，比對照組分別提高了5.03%和3.32%，飼料系數(shù)略低于對照組，比對照組分別降低了1.5%和1.0%。

2.2 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標的影響

由表3可知，在養(yǎng)殖8周結(jié)束后，與對照組相比，飼料中添加甘露寡糖的各試驗組團頭魴幼魚的肝臟超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均顯著升高(P＜0.05)，但添加 100、200 和 400 mg/kg 甘露寡糖的試驗組間并沒有顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比，飼料中添加甘露寡糖的各試驗組團頭魴幼魚的肝臟丙二醛含量顯著降低(P＜0.05)， 而各試驗組間則沒有顯著差異(P＞0.05)。

表2 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚生長性能的影響Table 2 Effect of dietary MOS on growth performance of juvenile blunt anout bream

表3 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴魚幼魚肝臟抗氧化指標的影響Table 3 Effect of dietary MOS on liver antioxidant parameters of juvenile blunt anout bream

2.3 腸道細菌16S r DNA-V3片段的 PCR擴增結(jié)果

圖1 腸道細菌16S r DNA-V3片段的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of intestinal bacterial 16S rDNA-V3 fragment

將提取的細菌總基因組DNA為模版，進行1 6 SrDNA-V 3片段的PCR擴增，從圖1可知，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得200 bp左右的特異性擴增片段，每個樣品都有清晰、較亮的擴增條帶，可達到后續(xù)DGGE電泳分析要求。

2.4 16S r DNA-DGGE指紋圖譜的建立、聚類分析及相似系數(shù)分析

各組團頭魴幼魚腸道細菌16S rDNA-V3片段的DGGE指紋圖譜分析結(jié)果如圖2所示。比較DGGE各條帶相對光密度發(fā)現(xiàn)，部分條帶光密度變化明顯受到飼料中甘露寡糖含量的影響。有的條帶在各組的腸道樣品中均出現(xiàn)，如條帶21和22;有的條帶只在對照組中出現(xiàn)，如條帶2、3和10，有的條帶只在試驗組中出現(xiàn)，如條帶5。由圖3可知，團頭魴幼魚飼料中添加甘露寡糖會明顯改變團頭魴幼魚腸道的微生態(tài)環(huán)境，說明團頭魴幼魚腸道菌群易受甘露寡糖的影響，聚類分析結(jié)果表明12個樣品在0.6的相似度上可分為2類，其中400 mg/kg甘露寡糖組為一類，100和200 mg/kg甘露寡糖組及對照組為一類。

圖2 團頭魴幼魚腸道菌群DGGE指紋圖譜及分析示意圖Fig.2 Fingerprint and analysis schematic diagram of intestinal microflora of juvenile blunt anout bream by DGGE

圖3 團頭魴幼魚腸道菌群的UPMGA聚類分析示意圖Fig.3 UPMGA cluster analysis schematic diagram of intestine microflora of juvenile blunt anout bream

2.5 腸道菌群的Shannon-Wiener指數(shù)分析

由表4可知，投喂含200和400 mg/kg甘露寡糖飼料的團頭魴幼魚腸道菌群Shannon-Wiener指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，對照組腸道菌群的 Shannon-Wiener指數(shù)為 2.33，100、200 和 400 mg/kg 甘露寡糖組分別為 2.21、1.63 和 1.65，隨著甘露寡糖添加量的增加，團頭魴幼魚腸道菌群Shannon-Wiener指數(shù)逐漸減小，且200和400 mg/kg甘露寡糖組較對照組顯著降低(P＜0.05)。

表4 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴魚幼魚腸道菌群Shannon-Wiener指數(shù)的影響Table 4 Effect of dietary MOS on Shannon-Wiener index of intestinal microflora of juvenile blunt anout bream

2.6 DGGE條帶的16Sr DNA序列分析

團頭魴幼魚腸道細菌16S rDNA-V3特征片段經(jīng)DGGE分離，切割特征性條帶1～24，序列大小在160～200 bp范圍之內(nèi)。將所得序列輸入Gen-Bank，以Blast進行相似性分析。由表5可知，24條所測序列的最相似序列基本來自GenBank數(shù)據(jù)庫中未培養(yǎng)的細菌克隆，所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列相似度均在95%～100%之間。100、200和400 mg/kg甘露寡糖組團頭魴幼魚腸道優(yōu)勢菌為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)，而對照組團頭魴腸道中含有弧菌門(Vibriogazogenes)。

表5 DGGE凝膠條帶回收序列分析結(jié)果Table 5 The analysis results of DGGE gel band recovery sequences

3 討 論

3.1 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚生長性能的影響

基于國內(nèi)外對甘露寡糖作用機理的研究，Sims等［2］和 Rozeboom 等［3］分別研究證實甘露寡糖在斷奶仔豬和育雛雞上具有抑制有害菌吸附、促進有益菌增殖，以及提高機體免疫力的作用，而國外的一些報道對飼料中添加適宜的甘露寡糖是否能夠有效促進水產(chǎn)動物生長性能尚存在較大的爭議［11－14］。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚的增重率、飼料系數(shù)和成活率均沒有顯著影響，本研究結(jié)果與在哺乳動物動物上的研究結(jié)果存在較大差異的原因有3個方面:首先，不同食性魚類在消化道的長短及消化道微生物組成與哺乳動物之間有很大差異，可能對飼料中甘露寡糖的敏感性不同［15］，即使甘露寡糖能夠促進有益菌的增殖，但優(yōu)勢益生菌如何促進魚體的生長有待于進一步研究;其次，動物不同發(fā)育階段也可能是造成差異的重要原因之一［16］;再次，任何營養(yǎng)物質(zhì)或添加物在動物中起作用都需要一定的時間，試驗周期太短也可能是甘露寡糖效果沒有體現(xiàn)的原因之一。

3.2 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚抗氧化能力的影響

迄今，關(guān)于甘露寡糖對水生動物的作用研究主要集中在免疫反應(yīng)方面［17－19］。由超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等組成的抗氧化酶系統(tǒng)可清除過多的自由基，減少脂質(zhì)的過氧化損傷，其中超氧化物歧化酶是體內(nèi)以超氧陰離子自由基(O－2·)為唯一底物的酶類和自由基連鎖反應(yīng)的阻斷劑，它可特異性地催化超氧化物自由基歧化為過氧化氫和氧;過氧化氫在過氧化氫酶的作用下生成無毒性的水和氧。因此，檢測動物超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的變化能比較準確地反映機體內(nèi)的抗氧化狀況。本試驗結(jié)果表明，100、200和400 mg/kg甘露寡糖組的肝臟超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均顯著高于對照組，與王銳等［20］對異育銀鯽、劉愛君等［21］對羅非魚、于艷梅等［22］對黃顙魚的研究結(jié)論相似。丙二醛是脂質(zhì)過氧化物的主要分解產(chǎn)物，能引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的交聯(lián)聚合，導(dǎo)致細胞死亡。眾所周知，丙二醛含量升高與氧自由基產(chǎn)生過多密切相關(guān)，本試驗結(jié)果表明攝食含100～400 mg/kg甘露寡糖飼料的團頭魴幼魚的肝臟丙二醛含量較對照組顯著降低。這暗示飼料中添加甘露寡糖可以有效提高機體的抗氧化防御能力，使過量活性氧自由基(ROS)在尚未發(fā)揮毒性作用前就被消除，從而保持機體ROS的穩(wěn)態(tài)平衡。

3.3 飼料中添加甘露寡糖對團頭魴幼魚腸道菌群的影響

姚延丹等［23］認為DGGE帶譜中的每個條帶代表1個可能的細菌類群或可操作分類單元。本研究發(fā)現(xiàn)在團頭魴幼魚腸道中細菌豐富度較高，通過DGGE圖譜中的條帶數(shù)目變化可知，攝食不同含量甘露寡糖飼料的團頭魴腸道菌群生物多樣性具有明顯的差異性，由此可知，飼料中添加甘露寡糖改變了團頭魴幼魚原有的腸道微生態(tài)環(huán)境，即魚腸道微生態(tài)環(huán)境易受飼料中甘露寡糖含量的影響，這與在羅非魚上的研究結(jié)果［24－25］一致。杜英男等［26］也發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能提高動物腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，阻止病原菌的定植。本研究表明，對照組腸道中存在弧菌門，而攝食100、200和400 mg/kg甘露寡糖的幼魚腸道優(yōu)勢菌為放線菌門、變形菌門、硬壁菌門，這些細菌類群中包含雙歧桿菌、芽孢桿菌等益生菌。此外，DGGE圖譜分析表明團頭魴幼魚腸道中變型菌門含量較高，Yang 等［27］和 Kim 等［28］研究分別表明河豚和虹鱒腸道中變型菌門含量豐富，與本研究結(jié)果相一致，說明變型菌門是魚類腸道菌群中的優(yōu)勢種屬。研究結(jié)果提示，飼料中添加適量甘露寡糖能夠促進團頭魴幼魚腸道內(nèi)益生菌的增殖，保證正常的微生態(tài)平衡和正常的消化道內(nèi)環(huán)境，進而對病原菌入侵有較好的保護作用。

4 結(jié)論

①飼料中添加甘露寡糖可提高團頭魴幼魚的抗氧化能力。

②飼料中添加200～400 mg/kg甘露寡糖可改善團頭魴幼魚的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

［1］ 吳淑勤，王亞軍.我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害控制技術(shù)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.中國水產(chǎn)，2010(8):9－10.

［2］ SIMS M D，DAWSON K A，NEWMAN K E，et al.Effects of dietary mannan oligosaccharide，bacitracin methylene disalicylate，or both on the live performance and intestinal microbiology of turkeys［J］.Poultry Science，2004，83(7):1148－1154.

［3］ ROZEBOOM D W，SHAW D T，TEMPELMAN R J，et al.Effects of mannan oligosaccharide and an antimicrobial product in nursery diets on performance of pigs reared on three different farms［J］.Journal of Animal Science，2005，83(11):2637－2644.

［4］ 明建華，謝駿，徐跑，等.團頭魴(Megalobrama amblycephala)兩種熱休克蛋白70(HSP70s)的原核表達、純化及鑒定［J］.海洋與湖沼，2012，43(1):185－191.

［5］ 崔紅紅，劉波，戈賢平，等.肌醇對氨氮應(yīng)激下團頭魴幼魚免疫的影響［J］.水產(chǎn)學報，2014，38(2):228－236.

［6］ 徐磊，劉波，謝駿，等.甘露寡糖對異育銀鯽生長性能、免疫及HSP70基因表達的影響［J］.水生生物學報，2012，36(4):656－663.

［7］ AKRAMI R，RAEZGHI-MANSOUR M，CHITSAZ H，et al.Effect of dietary mannan oligosaccharide on growth performance，survival，body composition and some hematological parameters of carp juvenile(Cyprinus carpio)［J］.Journal of Animal Science Advances，2012，2(11):879－885.

［8］ STAYKOV Y，SPRING P，DENEV S，et al.Effect of a mannan oligosaccharide on the growth performance and immune status of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)［J］.Aquaculture International，2007，15(2):153－161.

［9］ DIMITROGLOU A，MERRIFIELD D L，SPING P，et al.Effects of mannan oligosaccharide(MOS)supplementation on growth performance，feed utilisation，intestinal histology and gut microbiota of gilthead sea bream(Sparus aurata)［J］.Aquaculture，2010，300(1/2/3/4):182－188.

［10］ 李曉，李冰，董玉峰，等.精養(yǎng)團頭魴池塘沉積物微生物群落的結(jié)構(gòu)特征及組成多樣性分析［J］.水產(chǎn)學報，2014，38(2):218－227.

［11］ DIMITROGLOU A，MERRIFIELD D L，MOATE R，et al.Dietary mannan oligosaccharide supplementation modulates intestinal microbial ecology and improves gut morphology of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss(Walbaum)［J］.Journal of Animal Science，2009，87(10):3226－3234.

［12］ GENC M A，AKTASM，GENC E，et al.Effects of dietary mannan oligosaccharide on growth，body composition and hepatopancreas histology of Penaeus semisulcatus(de Haan 1844)［J］.Aquaculture Nutrition，2007，13(2):156－161.

［13］ DANIELSC L，MERRIFIELD D L，BOOTHROYD D P，et al.Effect of dietary Bacillus spp.and mannan oligosaccharides(MOS)on European lobster(Homarus gammarus L.)larvae growth performance，gut morphology and gut microbiota［J］.Aquaculture，2010，304(1/2/3/4):49－57.

［14］ GRISDALE-HELLAND B，HELLAND S J，GATLINⅢ D M，et al.The effects of dietary supplementation with mannanoligosaccharide，fructooligosaccharide or galactooligosaccharide on the growth and feed utilization of Atlantic salmon(Salmo salar)［J］.Aquaculture，2008，283(1/2/3/4):163－167.

［15］ 王紅寧.鯉腸道正常菌群的研究［J］.水生生物學報，1994，18(4):354－359.

［16］ DAVIS M E，MAXWELL C V，BROWN D C，et al.Effect of dietary mannan oligosaccharides and(or)pharmacological additions of copper sulfate on growth performance and immunocompetence of weanling and growing/finishing pigs［J］.Journal of Animal Science，2002，80(11):2887－2894.

［17］ GU M，MA H M，MAI K S，et al.Effects of dietary βglucan，mannanoligosaccharide and their combinations on growth performance，immunity and resistance against Vibrio splendidus of sea cucumber，Apostichopus japonicus［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2011，31(2):303－309.

［18］ TORRECILLAS S，MAKOL A，CABALLERO M J，et al.Immune stimulation and improved infection resistance in European sea bass(Dicentrarchus labrax)fed mannan oligosaccharides［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2007，23(5):969－981.

［19］ SANG H M，F(xiàn)OTEDAKAR R，F(xiàn)ILER K.Effects of dietary mannan oligosaccharide on the survival，growth，immunity and digestive enzyme activity of freshwater crayfish，Cherax destructor Clark(1936)［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(2):e629－e635.

［20］ 王銳，劉軍，劉輝宇.半乳甘露寡糖對異育銀鯽幼魚生長和非特異性免疫的影響［J］.上海水產(chǎn)大學學報，2008，17(4):502－506.

［21］ 劉愛君，冷向軍，李小勤，等.甘露寡糖對奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O.aureus)生長、腸道結(jié)構(gòu)和非特異性免疫的影響［J］.浙江大學學報:農(nóng)業(yè)與生命科學版，2009，35(3):329－336.

［22］ 于艷梅，吳志新，陳孝煊，等.魔芋甘露寡糖對黃顙魚非特異性免疫功能及生長的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2010，29(3):351－355.

［23］ 姚延丹，李谷，陶玲，等.復(fù)合人工濕地－池塘養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)細菌多樣性研究［J］.環(huán)境科學與技術(shù)，2011，34(7):51－55.

［24］ 馬相杰，汪立平，趙勇，等.甘露寡糖對羅非魚幼魚腸道微生物的影響［J］.微生物學通報，2010，37(5):708－713.

［25］ 呂慧源，周志剛.飼喂果寡糖對奧尼羅非魚Oreochromisaurea ×O.nilotica♀腸道菌群、成活率及生長性能的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2007，19(6):691－697.

［26］ 杜英男，鞠貴春，薛軍，等.果聚糖和甘露寡糖對水貂腸道菌群影響的研究［J］.經(jīng)濟動物學報，2007，11(2):83－86.

［27］ YANG G M，BAO B L，PEATMAN E，et al.Analysis of the composition of the bacterial community in puffer fish Takifugu obscurus［J］.Aquaculture，2007，262(2/3/4):183－191.

［28］ KIM D H，BRUNT J，AUSTIN B.Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)［J］.Journal of Applied Microbiology，2007，102(6):1654－1664.