陳少魁 劉玉蘭 李 權(quán) 朱惠玲 侯永清 吳歡聽 王秀英 劉 稱

(武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，武漢 430023)

免疫應(yīng)激導(dǎo)致仔豬生長抑制和飼料利用率降低［1］，給畜牧生產(chǎn)造成一定的經(jīng)濟損失。研究表明，免疫應(yīng)激與炎性細胞因子的過量產(chǎn)生密切相關(guān)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)等［1］。這些炎性細胞因子可通過作用于外周組織或影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而導(dǎo)致生長抑制［1］。因此，調(diào)控炎性細胞因子的產(chǎn)生是緩解免疫應(yīng)激的有效手段。

Toll樣受體(TLRs)是近年來才發(fā)現(xiàn)的和免疫密切相關(guān)的受體家族，為一類模式識別受體，通過識別不同病原體的病原相關(guān)的分子模式(PAMP)在天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中Toll樣受體4(TLR4)是脂多糖(LPS)的受體，是TLRs家族中研究最多的一種。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs為機體炎性反應(yīng)鏈的啟動蛋白，TLRs被激活后，可以激活其下游一系列信號分子，如髓樣分化因子88(MyD88)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)等，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的激活，而活化的NF-κB可以促進炎性細胞因子基因，如TNF-α、IL-1和IL-6的表達，從而啟動機體的炎癥反應(yīng)［2］。

研究表明，當機體處于免疫應(yīng)激狀態(tài)時，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間是相互作用、相互影響的［3］。當受 LPS刺激時，TLR4信號通路被激活，導(dǎo)致NF-κB的激活，從而釋放大量炎性細胞因子，而炎性細胞因子對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［4］。因此，我們可以推測TLR4信號通路也可能對仔豬神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控作用，從而對免疫應(yīng)激起調(diào)控作用。在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是最主要的應(yīng)激軸［3］。本研究通過給斷奶仔豬注射LPS以模擬免疫應(yīng)激狀態(tài)，研究免疫應(yīng)激對斷奶仔豬HPA軸TLR4信號通路關(guān)鍵基因(包括TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6 和 NF-κB)mRNA 表達水平的影響，旨在為探索TLR4信號通路與免疫應(yīng)激之間的相關(guān)性提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計

選擇 12 頭平均體重為(13.76±1.13)kg 的“杜×長×大”斷奶仔豬，按體重相近原則，隨機分配到2個組中，每個組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。預(yù)試10 d后，試驗組注射100μg/kg體重的LPS(大腸桿菌血清型055∶B5，Sigma 公司)(LPS 組)，對照組注射等量的生理鹽水。試驗前12 h停水停料。

1.2 血液樣品采集及測定

1.2.1 樣品采集

于注射LPS或生理鹽水后4 h，從仔豬前腔靜脈用肝素抗凝真空管分別采血7 mL離心(3 500 r/min，10 min)，分離血漿，-80 ℃ 保存待測。

1.2.2 測定方法

采用放射免疫試劑盒(購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司)測定TNF-α含量;采用放射免疫試劑盒(購自北京北方生物技術(shù)研究所)測定皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量。

1.3 組織樣品采集

注射LPS或生理鹽水4 h后，屠宰，取下丘腦、垂體、腎上腺，立即投入液氮凍存，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于提取組織總RNA。

1.4 mRNA 表達分析

1.4.1 主要儀器與試劑

7500 Real-time PCR儀(Applied Biosystems)、梯度升降溫功能 PCR儀(TaKaRa)、Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo)、Tanon-4100凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)?？俁NA提取試劑RNAiso Plus、cDNA合成試劑盒 PrimeScript RT reagent kit with gDNA eraser和real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4.2 測定方法

組織總RNA提取、cDNA合成、real-time PCR參照陳逢等［5］的方法。相對熒光定量PCR數(shù)據(jù)的計算采用 Livak 等［6］的 2-ΔΔCt法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因。根據(jù)已發(fā)表的豬的 TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB、GAPDH的基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計real-time PCR引物(表1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 17.0軟件進行 t檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。以P＜0.10表示具有顯著性趨勢，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激對斷奶仔豬血漿炎性細胞因子和激素含量的影響

由表2可知，LPS刺激后，血漿 TNF-α、皮質(zhì)醇和ACTH含量顯著上升(P＜0.05)。LPS對血漿CRH 含量無顯著影響(P＞0.05)。

2.2 LPS刺激對仔豬TLR4信號通路關(guān)鍵基因表達的影響

TLR4信號通路關(guān)鍵基因 TLR4、MyD88、IRAK1、TRAF6、NF-κB 的 mRNA 表達水平見圖 1～圖5。LPS刺激導(dǎo)致TLR4在下丘腦、垂體、腎上腺中的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)(圖1)。LPS刺激導(dǎo)致MyD88在垂體、腎上腺中的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，在下丘腦中的mRNA表達水平有升高的趨勢(P＜0.10)(圖 2)。LPS刺激有提高IRAK1在垂體、腎上腺中mRNA表達水平的趨勢(P＜0.10)，在下丘腦中無顯著變化(P＞0.05)(圖3)。LPS刺激導(dǎo)致 TRAF6在下丘腦、垂體、腎上腺中的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)(圖4)。LPS 刺激導(dǎo)致 NF-κB 在垂體中的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)，在下丘腦、腎上腺中無顯著變化(P＞0.05)(圖 5)。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

表2 LPS刺激對斷奶仔豬血漿炎性細胞因子和激素含量的影響Table 2 Effects of LPS challenge on plasma proinflammatory cytokine and hormone contents of weaner piglets

圖1 LPS刺激后TLR4 mRNA表達水平變化Fig.1 The change of TLR4 mRNA expression level after LPS challenge

圖2 LPS刺激后MyD88 mRNA表達水平變化Fig.2 The change of MyD88 mRNA expression level after LPS challenge

圖3 LPS刺激后IRAK1 mRNA表達水平變化Fig.3 The change of IRAK1 mRNA expression level after LPS challenge

圖4 LPS刺激后TRAF6 mRNA表達水平變化Fig.4 The change of TRAF6 mRNA expression level after LPS challenge

圖5 LPS刺激后NF-κB mRNA表達水平變化Fig.5 The change of NF-κB mRNA expression level after LPS challenge

3 討論

目前最經(jīng)典的模擬免疫應(yīng)激的方式是通過豬腹膜或靜脈注射一定劑量的LPS［7］。LPS能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生急性細菌感染癥狀，如厭食、嗜睡和發(fā)熱等［7］。LPS刺激會使巨噬細胞合成和分泌IL-1、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子。這些細胞因子可引起一系列代謝變化，同時它們也具有類似激素功能，可以將異源物質(zhì)入侵信號傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改變神經(jīng)內(nèi)分泌，尤其會導(dǎo)致HPA軸激活［7］。本試驗結(jié)果表明，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬血漿炎性細胞因子TNF-α、皮質(zhì)醇、ACTH含量顯著上升，這表明LPS刺激導(dǎo)致豬發(fā)生急性免疫應(yīng)激，HPA軸被激活。

TLRs是與免疫密切相關(guān)的模式識別受體(PRRs)［8］。目前已發(fā)現(xiàn)的 TLRs有10多種。其中，TLR4是識別LPS的關(guān)鍵分子，LPS刺激激活膜受體TLR4，TLR4與LPS聚合使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)。TLR4在胞內(nèi)翻譯起始區(qū)域與MyD88的羧基端結(jié)合，MyD88通過其死亡域與IRAK1的死亡域相結(jié)合，使IRAK1磷酸化。磷酸化后的IRAK1和TRAF6結(jié)合并使其激活。TRAF6最終使 NF-κB激活，活化的NF-κB最終轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，誘導(dǎo)炎性細胞因子(如 IL-1、IL-6、TNF-α 等)的過量表達，從而導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng)［9-10］。當動物機體遭受應(yīng)激或感染時，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間是相互作用、相互影響的，這提示TLR4信號通路可能具有調(diào)控免疫應(yīng)激仔豬神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用。又基于HPA軸是最主要的應(yīng)激軸［3］，本研究推測，TLR4可能對免疫應(yīng)激仔豬HPA軸有調(diào)節(jié)作用，但目前有關(guān)此方面的研究未見報道。

本試驗發(fā)現(xiàn)，LPS刺激導(dǎo)致TLR4傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因(TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB)mRNA 表達水平顯著上升，IRAK1 mRNA表達水平有升高趨勢。其變化趨勢與血漿TNF-α、皮質(zhì)醇、ACTH含量一致。目前，有關(guān)LPS刺激對仔豬HPA軸TLR4傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因表達的影響的研究未見報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激導(dǎo)致仔豬腸道、肝臟和肌肉TLR4信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達水平的上升［11-13］。與我們的研究結(jié)果類似，肖品品等［14］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài) 24 h后，TLR4在海馬組織中表達活性增強。王意［15］研究表明，在手術(shù)及麻醉后，老齡大鼠海馬CA3區(qū)TLR4、MyD88、NF-κB 及炎癥因子 TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6等都呈現(xiàn)表達水平增高的趨勢。此外，高音［16］發(fā)現(xiàn)，小鼠腦缺血再灌注狀態(tài)下，海馬CA1區(qū)和頂葉皮質(zhì)均出現(xiàn)TLR4過表達，從而引起其胞內(nèi)銜接蛋白MyD88表達水平增加，NF-κB被激活，并進一步導(dǎo)致炎癥因子 IL-1β和TNF-α的過表達。汪軍［4］也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠下丘腦和腎上腺TLR4表達水平增加，炎性細胞因子合成和分泌增加。本試驗結(jié)果提示，LPS應(yīng)激誘導(dǎo)下丘腦、垂體和腎上腺中TLR4傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因表達，導(dǎo)致炎性細胞因子的釋放，從而導(dǎo)致HPA軸的過度激活。然而，Kanczkowski等［17］報道，雖然在肝臟和造血系統(tǒng)中MyD88缺失的小鼠，LPS誘導(dǎo)的腎上腺炎癥和HPA軸激活顯著降低，但是在腎上腺皮質(zhì)中MyD88缺失的小鼠，其腎上腺炎癥和HPA軸的激活并未發(fā)生顯著改變。這表明免疫細胞(而不是腎上腺細胞)是LPS誘導(dǎo)的系統(tǒng)和腎上腺炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者。然而，Kanczkowski等［17］也指出，在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征的情況下，HPA軸激活并不完全依賴于系統(tǒng)TLRs信號。由此可見，HPA軸激活與TLR4信號通路的關(guān)系還需進一步試驗進行驗證。

4 結(jié)論

LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬HPA軸被激活，HPA軸中 TLR4傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因 TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB mRNA 表達水平顯著升高;IRAK1 mRNA表達水平有升高趨勢。

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